만성 요통에 희망을 주는 비바이러스 유전자 치료법

최근 Biomaterials 저널 에 발표된 연구에 따르면, 연구진은 생체 내 퇴행성 척추간판(IVD)에 조작된 세포외소포(eEV)를 사용하여 전사 인자 Forkhead Box F1(FOXF1)을 전달함으로써 디스크성 허리 통증(DBP)을 치료하는 새로운 비바이러스 유전자 치료법을 개발했습니다.

만성 요통 (LBP)은 인구 고령화와 오피오이드 중독 악화로 인해 전 세계적으로 증가하는 문제입니다. 현재 치료법은 단기적인 완화나 고비용 수술로 이루어져 있어, 중독성이 없고 덜 침습적인 치료법의 필요성이 부각되고 있습니다.

성장 인자 투여, 세포 치료, 바이러스 유전자 치료를 포함한 현재의 생물학적 접근법은 동물 및 인간 모델에서 퇴행을 줄일 수 있습니다. 그러나 단기적 효과, 낮은 장기 효능, 불필요한 면역원성 및 발암성과 같은 문제들이 이러한 접근법의 직접적인 적용을 방해할 수 있습니다.

이번 연구에서 연구진은 FOXF1-eEV를 사용하여 척추 디스크 퇴화(IVD)에 대한 비바이러스성 유전자 치료법을 확립했습니다.

연구진은 FOXF1 또는 pCMV6를 대조군으로 포함하는 플라스미드를 일차 마우스 배아 섬유아세포(PMEF)에 형질 전환시키고 나노입자 추적 분석(NTA)을 사용하여 eEV 샘플을 특성화했습니다.

연구팀은 정량 역전사 중합효소 연쇄 반응(qRT-PCR)과 기존 PCR을 이용하여 분자 물질이 eEV에 효율적으로 로딩되는 것을 평가했습니다. 웨스턴 블롯 분석을 통해 eEV 형성 과정에서 FOXF1과 EV 특이 단백질을 확인했습니다. 연구팀은 상부 및 하부 폴리링커 영역을 증강시키는 플라스미드를 사용하여 공여 세포에서 FOXF1 플라스미드 DNA의 존재를 확인하고 eEV를 생성했습니다.

그들은 eEV와 기증자 세포에서 플라스미드 DNA로부터 생성된 전장 mRNA를 조사했습니다.

연구자들은 DBP 동물 모델에서 조직 기능을 회복하고 통증 반응을 바꾸기 위해 전사 인자를 포함한 세포외 소포를 만들었습니다.

연구진은 디스크성 허리 통증을 앓는 마우스 모델에서 손상된 척추 디스크로 FOXF1을 운반하고 분포하는 EV를 식별하여 FOXF1 eEV가 척추 디스크 변성을 억제한다는 것을 확인했습니다.

연구팀은 마우스 추간판의 생체역학적 테스트와 영상, 세포외 기질(ECM) 변화, 12주 후에 평가된 통증 반응을 결합하여 치료적 개입으로 인해 유발된 구조와 기능의 변화 및 통증을 확인했습니다.

수술 전후 통증 평가에는 미세 컴퓨터 단층촬영(micro-CT), 자기공명영상(MRI), 기계적 검사, 알시안 블루(AB) 및 피크로시리우스 레드(PSR) 염색, 디메틸메틸렌 블루 검사, 면역조직화학(IHC)이 포함되었습니다.

이 연구에서는 연구자들이 수술 후 통증을 조절하기 위해 쥐에게 부프레노르핀 ER을 피하 주사로 투여하는 수술 기법을 사용했습니다.

연구팀은 수술 전과 수술 후 4주에서 12주까지 2주마다 다양한 방법을 사용해 행동 평가를 실시했습니다. 여기에는 개방형 들판 테스트, 냉각판, 꼬리 매달기, 철사 매달기 등이 포함되었습니다.

개방형 실험은 생쥐의 자발적인 활동을 평가하고, 냉각판 실험은 열 과민증을 측정하고, 꼬리 현수 실험은 축 통증을 측정하고, 철사 현수 실험은 강도를 측정합니다.

수술 12주 후, 연구팀은 대퇴 신경 및 동맥 추적을 이용하여 동물의 요추를 절개하여 L4와 L5, L5와 L6, 그리고 L6와 S1 IVD 사이의 추간판을 확인했습니다. L5/L6 IVD를 이용하여 조직학적 특징을 평가하고 글리코사미노글리칸(GAG) 함량을 측정했습니다.

FOXF1 eEV는 디스크 높이, 조직 수화, 프로테오글리칸 함량, 기계적 특성을 개선하는 등 IVD 구조와 기능을 회복하는 동시에 통증 반응을 크게 줄였습니다.

본 연구는 전사인자 FOXF1을 형질감염시킨 일차 섬유아세포에서 FOXF1이 포함된 eEVs의 방출에 초점을 맞추었습니다. 정량적 RT-PCR 분석 결과, pCMV6 형질감염 세포에 비해 FOXF1 mRNA 전사 수준과 FOXF1 mRNA의 전체 전사 수준이 유의미하게 증가했습니다.

FOXF1 eEV 치료는 최대 12주 동안 마우스의 요추 디스크 천자 모델에서 통증 반응을 감소시킬 수 있습니다. 암컷 마우스는 FOXF1 투여군에서 손상군보다 발작 시간이 더 길었으며, 손상군은 치료 후 최소 12주 동안 지속되었습니다.

FOXF1 eEV 치료는 수분 수준과 IVD 디스크 T2 강조 영상 강도를 유지하면서 생체 내 부상 및 퇴행성 동물의 IVD 조직 수분화와 높이를 개선했습니다.

그러나 연구팀은 손상된 동물과 pCMV6 eEV로 치료받은 동물에서 디스크 높이 감소를 관찰했습니다. FOXF1 eEV로 치료받은 생쥐는 치료 12주 후 디스크 높이 감소가 없었습니다. 성별은 기능적 결과에 영향을 미치지 않았습니다.

FOXF1 eEVs는 생체 내에서 손상되고 퇴화된 IVD의 기계적 기능을 회복시켰습니다. 축 응력 하에서, FOXF1 eEVs로 처리된 IVD는 손상된 IVD에 비해 더 높은 정상화된 NZ 강성을 나타냈습니다.

크립 조건 하에서 손상된 IVD는 정규화된 크립 변위가 증가하여 정규화된 크립 탄성 강성이 감소함을 나타냅니다.

연구 결과에 따르면 손상된 IVD의 GAG 함량을 줄이면 기계적 유연성이 증가하는 반면, eEV 치료는 글리코사미노글리칸 손실과 그에 따른 기계적 기능 변화를 방지합니다.

FOXF1 eEVs는 프로테오글리칸과 GAG 수치를 증가시켜 IVD의 구조적, 기능적 변화를 유도했습니다.

연구 결과에 따르면 발달 전사 인자가 가득한 eEV가 IVD를 통해 이러한 전사 인자를 퇴행성 관절과 통증성 관절에 전달함으로써 DBP와 같은 통증성 관절 질환을 치료할 수 있는 것으로 나타났습니다.

이 전략은 질병으로 인한 구조적, 기능적 이상을 줄이는 데 도움이 될 수 있으며, 성별에 따라 통증 반응을 조절할 수 있습니다.

연구진은 또한 FOXF1과 같은 발달 전사인자를 이용하여 퇴행성 나노입자 세포를 생체 내에서 동화작용 촉진 상태로 전환하는 방안을 제안했습니다. 치료 효능을 확인하기 위해서는 추가 연구가 필요합니다.