배아 줄기 세포

배아줄기세포의 발견은 우연이 아니라, 발생생물학 분야의 과학 연구라는 준비된 토대 위에서 이루어졌습니다. "줄기세포"라는 용어는 1908년 베를린 혈액학회에서 알렉산더 막시모프가 조혈세포와 관련하여 의학에 처음 도입했습니다. 안정적인 다능성 배아줄기세포 계통의 분리 및 생산이 이루어지기 훨씬 전부터, 기형줄기세포(배아암)는 초기 발생 과정 연구에 사용되었으며, 이를 통해 초기 유전자의 발현 순서와 그 활성에 따른 단백질 산물 등 미지의 배아 발생 기전이 연구되었습니다.

하지만 인간 유전체의 전능성은 진화 과정에서 돌이킬 수 없이 상실된 것일까요? 아닙니다. 배아 발생이 이를 증명합니다. 만약 그렇다면, 두 번째 진화적 발달 경로는 원칙적으로 언제쯤 실현될까요? 아마도 인간이 충분히 오랜 시간 동안 환경 조건이 비교적 일정하게 유지되는 우주로 진입할 때일 것입니다. 무중력 상태에서 뼈의 탈회(demineralization)는 매우 느리게 재형성되고 재생되는 과정으로, 인간이라는 종이 우주 환경에 적응하는 과정의 첫 단계로 볼 수 있습니다. 그러나 두 번째 진화적 발달 경로에 대한 대가는 다를 것입니다. 모든 세포의 전능성과 절대적인 가소성을 회복하는 대가는 불임이 될 것입니다. 따라서 이 "진화적 카멜레온"의 세계에서 우리는 감수분열 없이 출아법으로 번식해야 할 것입니다. 하지만 우리는 오래 살 것입니다. 텔로머라아제 불멸은 아메바의 불멸과 같습니다. 다세포 생물에서 줄기세포는 양적, 질적 장수의 기질입니다.

[ 1 ], [ 2 ], [ 3 ], [ 4 ]

배아줄기세포의 출처

오늘날 실험실 연구용 배아줄기세포의 공급원은 마우스 기형암종 세포주(129/sv, F19, F8, Zin 40, CGR 86, R1, CCE, JM-1, E14TG2a, CGRSb)와 인간 기형암종 세포주(NTERA-2, TERA-2, H-9 클론), 그리고 Trauneon ESC 세포주입니다. 그러나 면역 표현형, 염색체 분석 결과, mRNA 발현 프로파일, 노출된 수용체 및 세포 내 신호전달 단백질을 나타내는 상세한 세포 패스포트가 있다고 해서 기형암종 ESC 세포의 심각한 단점, 즉 전능성의 급속한 소실과 임상 시험에서의 사용 불가능성을 보완할 수는 없습니다. 또한, 배양 중 혼합 분화로 인해 이질적인 세포 집단에서 순수한 특수 세포주를 분리하는 것이 매우 어렵습니다. 따라서 임상적 목적으로 만들어진 배아줄기세포 계통의 공급원은 대개 배반포의 내세포괴, 8세포기 배아의 개별 배아포, 후기 단계의 모룰라 세포, 그리고 원시 생식 세포입니다.

기형암세포는 다능성을 가지고 있지만, 배아줄기세포에 비해 현저히 낮은 다능성을 특징으로 한다는 점에 유의해야 합니다. 배아줄기세포와의 융합은 키메라 형성으로 이어지는 경우가 드물며, 더 나아가 기형암세포의 유전자형을 가진 생식세포를 형성하지도 않습니다. 이는 기형암세포 배양 과정에서 Y 염색체 소실, 다양한 삼염색체, 결실 또는 전좌와 같은 염색체 이상이 빈번하게 발생하기 때문으로 여겨집니다.

인간 배아줄기세포(ESC)를 분리하려는 시도가 반복적으로 이루어졌지만, 정상적인 인간 배반포에 접근하기 어려워 아직 해결되지 않았습니다. 또한, 인간에서 염색체 이상 발생 빈도는 동물 배아발생보다 높습니다. 체외수정 후 얻은 초기 인간 배아의 대다수는 무질서한 염색체 모자이크 현상을 보이며, 수적, 구조적 이상을 보이는 경우가 많습니다. 심지어 배반포 단계에서도 정상 핵형을 가진 세포로 구성된 인간 배아는 20~25%에 불과합니다. 이러한 배아를 이용하여 배아줄기세포를 만드는 것은 사실상 불가능했는데, 접합자를 일반적으로 2배반포 또는 4배반포 단계까지 배양한 후 자궁에 이식했기 때문입니다. 수정된 인간 난자를 배반포 단계까지 배양하는 신뢰할 수 있는 기술은 비교적 최근에야 개발되었습니다. 이 기술을 시험관 수정 시술에 도입함으로써 착상 성공률이 높아졌을 뿐만 아니라, 정상 배반포의 접근성이 높아졌습니다.

또 다른 다능성 줄기세포 공급원은 원시 생식 세포입니다. 원시 생식 세포는 배아 상피의 더 발달된 전구 세포 집단과는 달리 표면에 베타-인테그린을 가지고 있지 않지만, 알칼리성 인산분해효소의 높은 활성을 발현합니다. 원시 생식 세포에서 형성된 줄기세포 집단은 1980년대부터 실험적으로 연구되어 왔습니다. 당시 생쥐 배아의 생식선 퇴화 부위에서 원시 생식 세포를 분리하는 기술이 개발되었습니다. 시험관 내에서 원시 생식 세포를 배양한 최초의 실패한 결과는 이러한 시도의 무의미함을 시사했습니다. 세포는 생존했지만 증식하지 못하고 첫날 안에 죽었기 때문입니다. 이후 생쥐 원시 생식 세포는 배양 배지에 가용성이고 막결합된 특정 폴리펩티드 성장 인자가 존재할 때만 시험관 내에서 번식한다는 것이 밝혀졌습니다. 수많은 연구 결과에 따르면, 일차 생식 세포의 생존과 증식을 위해서는 배양액 내 LIF뿐만 아니라 막결합 및 가용성 스틸 인자(SIF)의 존재가 필수적입니다. 이러한 펩타이드는 스틸 돌연변이에 대해 동형접합체인 배아의 체세포에서 생성되며, 그중 하나는 cKit 원암유전자의 리간드입니다.

포유류와 인간의 일차 생식 세포는 생식샘외에서 기원하며 생식 세포주의 클론 발달의 근원입니다. 원시 생식 세포주뿐만 아니라 모든 배아 조직과 배아외 중배엽의 기원은 초기 배아의 상배엽(일차 외배엽)이며, 이는 모자이크 구조적 구성을 가지고 있습니다. 초기 배아의 여러 부분을 미세외과적으로 제거하는 방법을 사용하여, 원시 생식 세포의 결정된 전구체 클론의 상배엽에 국소화 구역이 확립되었습니다. 세포 표지자로 사용된 로다민 덱스트란을 사용하여, 원시 생식 세포의 전구체가 배아외 외배엽 근처 상배엽의 근위 영역에 위치함을 확인했습니다. 원시 생식 세포주는 45세포 클론에서 발생하며, 이 클론의 할당은 낭배 형성 초기에 이루어집니다. 그런 다음 클론은 분리되고, 낭배 형성 과정에서 일차 생식 세포는 배아외 중배엽으로 이동하여 요막 퇴화부 기저부, 일차 선 뒤에서 발견됩니다. 그곳에서 일차 생식 세포는 후장 내배엽의 배쪽 부분으로 이동한 후 장간막을 따라 활발하게 이동하여 이동이 끝날 무렵 생식능선에 자리 잡습니다. 이동 중과 생식선 퇴화부에서 처음 2~3일 동안 일차 생식 세포는 활발하게 증식하여 8번의 복제 주기를 거칩니다. 이동 초기에 약 50개의 일차 생식 세포가 있다면, 발생 12일차 마우스 배아의 생식능선에는 일차 생식 세포의 수가 25,000개를 초과합니다.

배아줄기세포와 원시 생식세포의 기능적 유사성은 배아줄기세포가 배반포에 완전히 통합되어 내부 세포괴가 대체되고, 이후 원시 생식세포의 후손으로만 구성된 배아가 완전히 발달하는 것을 통해 입증됩니다. 다른 특성들에서도, 마우스 원시 생식세포는 배아줄기세포와 동일한 것으로 밝혀졌으며, 다양한 방향으로 분화하고, 시험관 내에서 배아체를 형성하며, 면역결핍 마우스에 피하 투여했을 때 생체 내에서 기형종을 형성하는 능력을 보였습니다. 이는 129/ter 마우스에서 자연적으로 발생하는 고환 기형종과 유사합니다.

LIF, 막결합 성장인자, 가용성 SIF를 배지에 첨가했을 때, 8일령 마우스 배아의 분리된 일차 생식 세포가 배양액에서 4일 동안 생존하고 번식한 후 사멸하는 것으로 나타났습니다. 또한, 배양액에서 일차 생식 세포가 사멸하는 시기는 암컷 일차 생식 세포가 생식선의 기초에서 감수분열에 돌입하고 수컷 일차 생식 세포의 체세포 분열이 차단되는 마우스 배아의 발달 단계(12.5~13.5일)와 일치합니다. 그러나 성장인자 LIF와 SIF뿐만 아니라 FGF2도 배지에 첨가하면 일차 생식 세포가 계속 증식하고, 배지에서 성장인자(SIF와 FGF)를 제거한 후에도 증식 가능한 세포 군집이 계대배양액에서 형성됩니다. 이러한 세포는 가용성 성장인자 LIF를 첨가하지 않고도 배아 섬유아세포 기질에서 장기간 배양할 수 있습니다. 원시 생식 세포에서 얻은 이러한 안정된 세포주를 배아 생식 세포라고 부르는 것이 제안되었습니다. 하지만 이 용어는 전혀 성공적이지 못합니다. EG 세포를 배양할 때 난자 형성이나 정자 형성의 후속 단계를 수행할 수 있는 배아 생식 세포를 얻을 수 없기 때문입니다. 이는 EG 세포주가 원시 생식 세포에서 유래했지만 배양 과정에서 배아 만능줄기세포의 특성을 획득함에 따라 생식 세포 계통으로 분화할 수 있는 능력을 상실하기 때문입니다. 다시 말해, 원시 생식 세포는 배양 시 생식 세포 전구체의 특성을 상실하고 배아줄기세포 유사 만능 세포로 변형됩니다.

면역결핍 마우스에 EG 세포를 도입했을 때 기형종이 발생하지 않는다는 사실이 밝혀졌습니다. 인간 EG 세포가 기형종을 생성하는 능력을 상실한 것은 이러한 세포주가 배양된 일차 생식 세포에서 직접 생성된 것이 아니라 배아체에서 분리된 세포에서 유래되었기 때문으로 추정됩니다. 따라서, 이들은 다능성을 가지지만 이미 분화가 결정된 세포의 후손일 가능성이 있습니다.

EG 세포와 원시 생식 세포 사이에는 근본적인 차이가 있다는 점에 유의해야 합니다. 원시 생식 세포는 키메라 마우스 배아를 얻을 수 없는데, 이는 원시 생식 세포가 내세포괴 또는 영양외배엽에 통합될 능력이 없음을 시사합니다. 원시 생식 세포 집단의 특성은 후기 배아의 체세포 계열과 더 유사하며, 이를 배반포에 도입하더라도 키메라 배아 형성으로 이어지지 않습니다.

EG 세포 응집을 통해 얻은 배아체 배양 기술을 변형하여 선택 배지에서 선별하여 "배아체 유래 세포"(EBD 세포)라는 또 다른 만능 세포 집단을 얻을 수 있었습니다. EBD 세포는 배양액에서 장기간 증식할 수 있어 안정적인 수임 세포(committed cell) 세포주를 만들 수 있었습니다. 이를 통해 다양한 특수 세포의 mRNA와 단백질 마커를 발현하는 세포 클론을 얻을 수 있었습니다. 이러한 접근 방식은 궁극적으로 인간의 일차 생식 세포가 만능성을 가지고 있으며, 시험관 내에서 뉴런, 신경아교세포, 혈관 내피세포, 조혈세포, 근육세포, 내배엽세포 등 다양한 세포 유형으로 분화됨을 증명했습니다.

배아줄기세포의 대체 공급원

인간 배아줄기세포주의 다른 공급원으로는 잡종 세포가 있을 수 있습니다. 인간 태아의 체세포와 전핵이 제거된 소의 난자를 전기천공법으로 융합하여 얻은 이종성 구조물을 가임신 소의 자궁에 이식하면 착상 전 발달 단계의 인공 배아로부터 내부 세포괴를 얻을 수 있습니다. 이를 위해 첫 번째 단계에서 인간 세포핵을 이식한 소의 난자에서 배반포를 얻습니다.

두 번째 단계에서는 배반포에서 배아모세포를 분리하고, 이로부터 톰슨 방법을 이용하여 배아줄기세포(ESC)를 분리합니다. 이 방법을 이용하여 ESC 세포주를 분리하는 데 있어 가장 우수한 결과는 인체 내에서 동면 상태로 존재하는 난포세포 또는 일차 생식세포의 핵을 이용하여 얻은 결과라는 점이 주목할 만합니다. 이는 소의 난자에 이식된 인간 세포의 핵이 텔로미어가 짧아지지 않고 높은 텔로미어 분해 효소 활성을 가져야 하기 때문이며, 이는 잡종란에서 얻은 ESC 클론의 조기 노화를 방지하는 데 도움이 됩니다(Repin, 2001). ESC의 가장 중요한 세포내 표지 단백질은 소위 크로마틴 침묵 단백질(chromatin silencer protein)에 속하는 Oct3, Oct4, Tcf, Groucho인 것으로 알려져 있습니다. 침묵 단백질은 이종 크로마틴을 매우 조밀하게 포장하여 유크로마틴 루프(euchromatin loop) 형성을 방지합니다. 이러한 단백질에 의한 크로마틴 포장은 ESC 유전체의 전능성과 상관관계가 있습니다. 현재까지 성숙한 소와 인간의 난모세포만이 세포질에 고농도의 침묵 단백질을 함유하는 특수 세포라는 것이 밝혀졌습니다. 이를 바탕으로, 체세포 핵을 핵이 제거된 소 난모세포에 이식하여 하이브리드 배아줄기세포를 얻는 방법이 개발되었습니다. 예비 시험관내 연구에서는 소 난모세포의 세포질이 12~24시간 배양 후 인간 체세포 핵 유전체의 전능성을 회복시키는 것으로 나타났습니다.

특히 흥미로운 것은 인간 배아의 착상 전 발달 특성에 대한 데이터인데, 이는 생쥐보다 전능성 세포가 다능성 세포 집단으로 더 늦게 대체되었음을 시사한다. 세포 형질전환 연구에서는 배아줄기세포 외에도 영양막 세포가 인간 배반포의 내세포괴 세포에서도 생성된다는 것을 보여주었는데, 이는 영양막 세포의 총체적인 효능을 시사한다.

배반포 단계에서 두 가지 다른 방식으로 결정된 세포 집단이 발생하는 것으로 알려져 있습니다.그 중 하나는 배반포의 바깥층인 영양외배엽을 형성하며, 그 파생물은 영양막 세포와 태반의 다른 배아 구성 요소입니다.두 번째 세포 집단은 영양외배엽의 안쪽 표면에 접하는 고밀도 덩어리로 그룹화됩니다.내부 세포 덩어리 세포 집단의 파생물은 모두 배아 기관의 조직과 기초입니다.후기 배반포 단계에서 내부 세포 덩어리에서 배아외 내배엽이 형성되고 상배엽(1차 외배엽)이 형성됩니다.이 경우 상배엽 세포는 다능성을 유지하지만 배아외 내배엽 세포를 분화하는 능력은 제한적입니다.

[ 5 ], [ 6 ], [ 7 ], [ 8 ], [ 9 ], [ 10 ], [ 11 ]

인간 배아줄기세포 확보

최근까지 영양막세포에서 배아줄기세포를 얻는 것은 불가능하다고 여겨졌습니다. 그러나 배반포에서 분리된 이배체 영양외배엽 줄기세포는 LIF 대신 FGF2와 헤파린이 포함된 배지에서 증식하고 줄기세포로 전환됩니다. 배지에서 FGF2를 제거하면 영양외배엽 세포의 증식이 멈추고 염색체 내재중복이 시작되어 영양외배엽 세포 구성 요소가 점차 거대 영양막세포로 전환됩니다. FGF2는 혈장 수용체(FGFR2)에 결합하여 세포질 내 MAP 키나제인 ERK1과 ERK2를 활성화하기 때문에, LIF는 영양외배엽 세포의 증식을 자극하지 않는 것으로 보입니다. 결과적으로, 하나의 신호 전달 경로(LIF - gpl30 - JAK 키나아제 - STAT3)가 배반포 세포에서 켜지면, 내세포괴의 세포들이 다능성 배아줄기세포로 전환되고, 두 번째 막관통 신호 전달 메커니즘(FGF2 - FGFR2 - MAP 키나아제 ERK1/ERK2)이 활성화되면, 영양외배엽 줄기세포가 배반포에서 형성됩니다. 신호 전달 경로의 선택은 다시 oct4 유전자의 활성에 따라 달라집니다. POU 도메인에 속하는 이 유전자는 17번 상염색체의 t 위치에 위치하며, 난자형성, 분열기, 배반포 내세포괴의 세포 및 1차 생식 세포에서 발현됩니다. oct4 유전자의 기능적 역할은 다능성 세포의 출현, 분화 및 역분화에 필요한 전사 인자를 인코딩하는 것입니다.

배아줄기세포에서 oct4 유전자의 발현은 이 전사인자와 보조인자의 상호작용에 따라 달라진다. 배반포에서 oct4 발현을 직접 조절한 결과, oct4 활성이 감소하면 세포의 절반이 영양외배엽을 형성하는 반면, oct4 발현이 유도 증가하면 배아줄기세포가 우세하게 생성되는 것으로 나타났다.

실험에서, 배아줄기세포는 난할 단계, 낭배 형성 단계 및 배아 발달 후기 단계에서 전능성 할구를 배양하는 동안 세포주로 이식될 수 없습니다. 마우스 배아줄기세포는 일반적으로 임신 3.5~4.5일에 분리되는데, 이는 정상적인 배아 발생의 여섯 번째 단계(단층 배반포)와 일곱 번째 단계(이층 배반포 - 초기 난실)에 해당합니다. 분명히, 마우스 배아는 착상 전 기간에만 배아줄기세포로 전환될 수 있는 세포 집단을 포함합니다. 따라서 배아줄기세포의 분리는 배아 발생의 특정 단계에서만 가능합니다. 난할 과정에서 발생하는 접합자와 할구는 배아막과 태반을 가진 생존 가능한 배아로 발달할 가능성 측면에서 전능성을 갖습니다. 생식 세포의 총 효능은 상실배 후기부터 소실되기 시작하며, 이 시기에 할구의 추가 투입은 위치에 따라 달라집니다. 초기 모룰라 배아는 전능성을 유지하는데, 이는 위치를 바꾸는 등의 국소화 실험적 조작이 완전한 배아의 발달을 방해하지 않기 때문이다.

배아줄기세포를 줄기세포로 분리하는 효율은 이식 당시 배반포의 상태에 영향을 받는다는 것이 확인되었습니다. 임신 3.5일째에 난소를 절제하고 프로게스테론을 투여한 생쥐의 생식관에서 7일간의 휴면을 모델링한 후 배반포를 사용하면 배아줄기세포주의 분리 성공률이 더욱 높아집니다. 이러한 조건에서 내세포괴를 형성하는 할구의 수가 증가하는 것으로 추정됩니다. 또한 세포 주기가 연장되어 대부분의 할구가 G0기로 진입할 가능성도 있습니다.

또한, 안정적인 만능성 배아줄기세포(ESC)의 생성은 배아의 유전자형에 따라 달라집니다. 129 마우스 계통의 배반포에서는 ESC를 비교적 쉽게 분리할 수 있지만, CS7BL/6 마우스에서는 훨씬 더 어렵고, CBA/Ca 마우스의 배반포에서는 ESC를 분리하는 것이 사실상 불가능합니다. 초기 배아는 만능성 ESC의 발달에 영향을 미치는 몇 가지 유전적 특징을 가지고 있음이 분명합니다. 그럼에도 불구하고, 분리된 상배반포(epiblast)를 배양하고 분화 세포를 선택적으로 선별하는 방법을 통해 CBA/Ca 마우스의 초기 배아에서도 ESC를 분리할 수 있었습니다.

배반포에서 배아줄기세포(ESC)를 얻는 검증된 표준 기술은 초기 배아 실험 기법에 대한 실험실 매뉴얼에 제시되어 있습니다. 실험용 배아줄기세포는 4.5일 된 마우스 배아의 분리된 상배엽(1차 외배엽)을 다소 복잡한 미세외과 수술 기법과 변형된 배양 조건을 이용하여 배양하여 얻을 수도 있습니다. 이 경우 배아줄기세포(ESC) 형성 빈도가 배반포 내세포괴를 이용한 실험보다 훨씬 높았기 때문에, 이 시술의 노동 강도는 정당합니다.

ESC 세포주를 분리하기 위해 각 클론을 마이크로웰로 옮기고, 40~60개의 세포 덩어리를 배양한 후 다시 분산시킵니다. 이 과정을 여러 번 반복하면 플라스틱에 부착된 정상핵형 세포의 최대 증식률을 갖는 불멸화된 ESC 세포주를 얻을 수 있으며, 이 세포주는 50~100회 계대 배양 후에도 전능성과 높은 텔로머라제 활성을 유지합니다. ESC 세포주를 유지하는 과정에서 가장 큰 위험은 배지나 혈청이 세균 내독소로 오염되는 것입니다. 배양 배지에 미량의 내독소만 있어도 미성숙 생식세포가 대량 사멸할 수 있습니다. 선형 성장과 적절한 분산을 주의 깊게 모니터링하면, 배양 중인 ESC는 대칭적 분열을 할 수 있으며, 두 딸세포 모두 다능성을 유지하고 무한한 횟수의 세포 주기를 수행하며, 이배체 핵형과 총 역가를 유지합니다.

녹색 형광 단백질(GFP) 합성을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 DNA 분자를 유전체에 형질감염시킨 후, 순수한 인간 배아줄기세포(ESC) 집단을 선별할 수 있습니다. ESC가 증식을 촉진하는 조건에서 배양될 때 GFP 발현이 증가하는 반면, 분화가 시작되면 이 유전자의 발현 수준이 감소하여 선택 배지에서 순수하고 안정적인 만능 세포주를 선별할 수 있습니다. GFP 선별법을 사용하여 분리된 ESC를 배양할 경우, 분화된 세포의 강력한 항증식 효과가 선별 배양 조건에서 제거되기 때문에 콜로니 형성 빈도가 몇 배나 증가합니다.

인간 배아줄기세포를 세포주로 전환하는 과정은 체외수정 과정 후 남아 있는 착상 전 배아(80~120개 세포 단계)에서 분리하는 방법을 사용하여 수행됩니다. 이를 위해 인공적으로 얻은 "잉여" 배아를 Delbecco-Eagle 배지에 기계적으로 분산시킵니다. 형광 표지된 선택적 단일클론 항체로 세포를 표지한 후, 배아모세포를 분리합니다. 배아모세포는 디스파제-콜라게나제 혼합물을 사용하여 개별 세포로 분산시킵니다. 분리된 세포는 특수 배지(80% Delbecco 배지 + 20% 태아송아지혈청, 500 μg/ml IL-6, LIF, SCF 함유)에서 처음 3회 계대 배양된 배아섬유아세포의 영양 단층 위에 배양합니다. 이 경우, IL-6, LIF, SCF의 효과로 줄기세포와 전구세포의 생존과 증식이 유지됩니다. 이러한 배지에서 배아줄기세포(ESC)는 부착되지 않은 공 모양의 세포들이 현탁된 클론 형태로 성장하며, 이 클론들은 부드럽고 반복적인 피펫팅을 통해 분리되어야 합니다. 새로운 클론들은 5~7일째에 현탁 배양액에 나타납니다. ESC의 최대 성장 속도는 10~15개 세포 수준에서 클론을 반복적으로 분리함으로써 달성됩니다. 그런 다음, 각 클론을 마이크로웰로 옮겨 40~50개 세포가 모이도록 배양합니다. 이 과정을 여러 번 반복하여 배양액의 부피를 6cm 접시당 500만~1,000만 개의 세포 밀도로 늘립니다. 이러한 계대 배양을 통해 톰슨은 인간 배아줄기세포의 불멸성 클론 10개를 분리했습니다. 이 클론들은 100회 계대 배양 후에도 높은 텔로머라제 활성, 활발한 증식 능력, 최소한의 표현형적 특징, 그리고 외배엽, 중배엽, 내배엽에서 유래한 350개의 특수 세포주로 분화할 수 있는 완전한 효능을 유지했습니다. 인간 배아줄기세포의 분화는 (배지 교체, 혈청 첨가, LIF 제거 후) 세포가 기질에 부착되면서 시작되었으며, 이는 세포골격의 발달과 접착 수용체의 발현을 시사한다. 중요한 점은, 무한 증식에도 불구하고 인간 배아줄기세포가 정상 핵형을 유지했다는 것이다.

인간 배아줄기세포주를 분리하는 두 번째 방법은 일차 생식세포를 이용하는 것입니다. 실험 연구에 따르면 12.5일령 마우스 배아의 생식주름에서 E 세포주를 얻을 수 있습니다. 그러나 이 경우 전구세포주 형성 빈도는 초기 배아를 대상으로 한 실험보다 현저히 낮았습니다. 동시에, 임신 13.5일령 마우스 배아의 생식샘에서 추출한 일차 생식세포는 전혀 세포주로 분화할 수 없었습니다.

최초의 안정적인 다능성 인간 EG 세포주는 5~9주령 배아의 생식샘에서 분리한 일차 생식모세포로부터 얻어졌습니다. 분리된 세포는 메르캅토에탄올, 포스콜린, 그리고 재조합 인간 성장인자(FGF와 LIF)가 보충된 태아 혈청이 포함된 DMEM 배지에서 불활성화된 마우스 배아 섬유아세포 기질 위에서 배양되었습니다. 7~12일 후, 배양액에 형태학적 특징과 분자적 마커로 볼 때 인간 EG 세포와 유사한 다세포 군집이 나타났습니다. 이 세포들은 응집 후 배아체를 형성하였고, 이후 발달하면서 세 배엽 모두의 유도체 특성을 가진 특수 세포들이 나타났습니다. 10~20회 계대 배양 기간 동안 EG 세포주는 정상적인 핵형을 유지했으며 다능성을 잃지 않았습니다.

LIF, 막결합 및 가용성 스틸 인자, 그리고 TGF-β의 복합 작용이 원시 생식 세포의 발달 프로그램을 변화시킨다는 것도 밝혀졌습니다. 원시 생식 세포는 유사 분열을 중단하고 난자 형성 또는 정자 형성으로 분화하기 시작하는 대신, 계속 증식합니다. 몇 차례의 추가 유사 분열 주기를 거치면 상피세포와 유사해지며, 생식 세포 전구체의 특성을 잃고 만능성 배아줄기세포(EG 세포)로 전환됩니다.

따라서 1998년, 인간 태아 부검 조직의 생식기 퇴화로부터 최초로 불멸화된 원시 생식 세포주가 분리되었습니다. 인간 배아 발생 과정에서 원시 생식 세포는 발생 3주차에 난황낭에 나타나고, 4~5주차에 생식 결절 영역으로 이동하여 휴면 상태의 일차 생식 모세포(primary gonocyte) 집단을 형성합니다. 비활성 상태에서 원시 생식 세포는 출생 시까지 배아에 보존됩니다. 5~9주차 배아의 태아 생식 결절에서 원시 생식 세포주를 분리하고, 추출된 조직을 콜라겐 분해 효소 IV-V형, 히알루로니다제, DNA 분해 효소의 혼합물로 즉석 처리하여 세포의 양적 및 질적 수율을 높입니다. 태아 생식결절 조직의 원시 생식세포는 기질(중간엽) 세르톨리 세포에 둘러싸여 있습니다. 세르톨리 세포의 기능적 목적은 항세포자멸사 인자(Fas 리간드), 유사분열 인자, 그리고 면역억제제를 생성하여 생식세포를 신체의 면역 공격으로부터 보호하는 것입니다. 또한, 생식결절의 기질 미세환경은 생식세포의 성숙에 중요한 역할을 합니다. 분리된 일차 생식세포는 처음 세 계대의 태아 섬유아세포로 구성된 영양 기질층 위에 배양됩니다. 가장 효과적인 유사분열 인자 조합은 LIF, FGF, 그리고 포스콜린(cAMP 형성 자극제)으로 구성된 복합체입니다. 시험관 내에서 일차 생식세포의 증식에는 태아 혈청이 필요하며, 태아 혈청이 존재하는 경우 배양액에서 일차 생식모세포의 증식과 함께 기질에 부착되지 않은 구형 세포 클론이 형성됩니다.

미국 국립보건원(NIH)은 배반포에서 인간 배아줄기세포(ESC)를 분리하는 방법에 대한 기존 데이터를 요약하여, 잘 형성된 내세포괴(inner cell mass)를 가진 배반포를 배양할 때 ESC를 성공적으로 분리할 가능성이 가장 높다는 예비 결론을 내렸습니다(Stem cells: scientific progress and future research direction. Nat. Inst, of Health USA). 이러한 관점에서, 세포주를 만들기 위한 최적의 ESC 공급원은 발생 5일차의 인간 배반포이며, 내세포괴를 분리할 때 영양외배엽(trophectoderm)을 조심스럽게 제거해야 합니다. 이 단계에서 30~35개의 세포로 구성된 분리된 내세포괴는 배아 마우스 섬유아세포 기질에서 배양해야 하며, 이는 배양 시 ESC 콜로니 형성에 결정적인 조건입니다.

배아줄기세포의 표현형적 특징 분석

특히 흥미로운 것은 배아줄기세포(ESC)의 표현형 특징에 대한 종간 비교 분석입니다. 인간 배아줄기세포 군집은 납작하고 상피세포와 유사한 세포들이 밀집되어 있는 반면, 마우스 배아체는 둥근 세포들이 느슨하게 모여 있는 것으로 나타났습니다. 인간 배아줄기세포의 핵-혈장 비율 지수는 마우스 배아줄기세포보다 낮습니다. 원숭이의 배아줄기세포는 가장자리가 고르지 않은 더 납작한 세포 군집을 형성합니다. 영장류 배아줄기세포의 초기 클론에서 개별 세포가 쉽게 관찰됩니다. 연구된 모든 동물 종의 증식하는 배아줄기세포는 MHC 클래스 I 및 II 분자를 발현하지 않습니다. 동시에, 인간 배아줄기세포는 TERA 1-60 및 GCTM-2 항체에 양성 반응을 보이는데, 이는 표면에 케라틴/콘드로이틴 황산 프로테오글리칸이 존재함을 나타내며, 이는 배아-(테라토)-암 줄기세포의 특징입니다. 모든 동물 종의 배아줄기세포에서 oct4 유전자의 발현은 표현형의 차이에도 불구하고, 만능성 유지를 담당하는 동일한 유전자 세트가 인간과 마우스 배아줄기세포에서 활성화되는 것으로 보인다는 것을 시사한다(Peru, 2001). 또한, 쥐, 돼지, 토끼, 영장류, 소 배아에서 분리된 배아줄기세포주는 유사한 형태학적 특성, 유사한 분자적 식별 마커 세트, 그리고 배아발생 프로그램을 실행하는 데 있어 거의 동일한 분자적 메커니즘을 가지고 있어, 이종이식 문제를 새로운 시각으로 바라볼 수 있게 해준다.

정상적인 생체 내 배아 발생과는 달리, 시험관 내 배아줄기세포의 증식은 배아층 형성을 동반하지 않고, 호메오틱 호크스 유전자(homeotic Hoxgene)의 차단을 배경으로, 즉 기관 형성 없이 진행됩니다. 체절 형성 유전자가 기능하지 않기 때문에, 체절 형성, 배아 체절 형성, 난황낭, 요막 및 기타 임시 기관 및 조직의 형성과 같은 배아 발생 시기를 배아줄기세포 배양에서 재현하는 것은 불가능합니다. 배양된 배아줄기세포는 350개의 특수 세포 제한 세포주 형성 과정 초기에 동결된 것으로 보입니다. 따라서, 딸 전구세포 클론과 중심부에 국한된 배아줄기세포는 배아의 모델일 뿐이며, 발달 과정에서 서로 다른 특수 세포주들이 서로 다른 조직 영역에서 동시에 형성되지만, 이 영역들은 공통 전구체에서 유래합니다. 배아줄기세포 표면에는 수용체가 매우 적음에도 불구하고, 초기 배아의 체적 구조를 모방하여 원시적인 형태발생 과정을 수행하는 능력을 유지합니다. 즉, 배양액에 배아줄기세포를 현탁하면 응집되어 배반포 또는 후기 배아(난실)와 유사한 구조를 형성합니다. 이러한 현탁 응집체는 각각 단순 배아체와 복합 배아체라고 합니다.

혼합 분화에서 외배엽(oct3, fgf-5, nodal), 내배엽(gata-4), 중배엽(brachyury), 심장형성 중배엽(pkh-2.5), 신경관(msx3), 그리고 조혈(elkf)의 초기 유전자들은 한 배아체의 여러 세포에서 동시에 발현됩니다. 시험관 내에서 생식세포 형성에 대한 표적 작용을 위해 성장인자와 사이토카인을 다양하게 조합하여 사용함으로써, 외배엽 또는 중배엽 유전자가 우선적으로 발현되는 배아체를 여러 사례에서 얻을 수 있었으며, 이는 낭배형성 및 기관 형성 초기 단계를 모델링하는 길을 열었습니다.

배아줄기세포(ESC)의 클론 성장은 비대칭 세포 분열의 증거로, 클론 중심부에 있는 단 하나의 ESC만이 무한한 증식 잠재력을 유지하는 반면, 두 번째 딸세포는 이미 분화 중인 전구세포 세대를 생성합니다. 따라서 배아체 주변부의 클론 증식률은 중심부보다 높습니다. 성장하는 클론의 변연부 세포는 자발적으로 무질서한 분화를 겪거나, 이동하거나, 세포자멸사 기전에 의해 사멸합니다. 이러한 과정들이 클론의 운명을 결정합니다. 증식률이 이동률과 세포자멸사 세포 사멸률을 초과하면 클론의 크기가 계속 증가하고, 세포자멸사 속도와 새로운 세포 형성 속도가 같을 때 안정화가 일어나고, 이러한 과정의 비율이 역수일 때 퇴화가 일어납니다. 전구세포는 대칭적으로 분열합니다. 즉, 두 딸세포 모두 이후 성숙한 특수 세포주로 분화합니다. 전구세포에 대한 ESC의 비율은 다양하지만, ESC의 수는 항상 전구세포 개체군의 극히 일부에 불과합니다. 따라서 신중한 피펫팅과 적절한 클론 분해만이 배양액 내 배아줄기세포(ESC) 수를 증가시킬 수 있습니다. 10-12개 세포 단계에서 클론을 분해하는 것이 최대 배아줄기세포 수율을 얻는 데 가장 효과적인 것으로 나타났습니다. 배아체 내 세포의 분화 방향과 정도는 위치에 따라 달라집니다. 배아체 외측 세포는 oct4 유전자를 발현하지 않으며, 1차 내배엽 세포로 분화하고, 이로부터 벽측 및 내장 배아외 내배엽의 상피 유사 세포가 형성됩니다. 배아체 내측 세포는 oct4 유전자를 발현하며 48시간 배양 동안 다능성을 유지합니다. 그러나 배양액은 형태학적으로 상피 단층으로 재구성되고 1차 외배엽 발달을 조절하는 유전자의 발현이 시작됩니다. 다음으로, 세 배엽 모두에서 유래된 다양한 세포 유형의 출현과 함께 완전 무질서 세포 분화 과정이 시작됩니다. 배아체 세포의 자발적 분화 과정에서 난황낭의 파편(낭포) 형태로 내배엽 표지자를 가진 응집체가 먼저 나타납니다. 그 후, 성장하는 모세혈관의 혈관모세포와 내피세포가 이러한 구조에 나타납니다. 자발적 분화의 마지막 단계에서는 배아체 내부 세포에서 신경세포, 신경교세포, 심근세포, 대식세포, 적혈구를 포함한 다양한 최종 분화 세포가 발생합니다. (배아 조직층 형성의 공간적 역전을 고려할 때) 어느 정도까지는 배아체를 이용하여 시험관 내에서 형태발생 과정을 연구하고 배아 세포 분화 초기 단계의 분자적 기전을 분석할 수 있습니다.또한 이러한 과정의 실행에 있어서 특정 유전자의 역할을 확립합니다.

따라서 클론 내에는 서로 다른 유전적 발달 프로그램이 발견된 세포, 즉 배아줄기세포(ESC), 초기 전구세포, 분화 전구세포 집단이 존재합니다. 영양층 없이, 그리고 배지에 LIF를 첨가하지 않고 매달아 떨어뜨리거나 대량 배양하는 방법으로 배아줄기세포를 배양하면 필연적으로 배아체가 형성됩니다. 배아체의 외층과 내층의 세포 형태는 다릅니다. 외층은 크고 분지된 세포로 구성되어 있습니다. 환경에 닿는 표면은 수많은 미세융모로 덮여 있습니다. 외층 세포는 라이헤르트막과 유사한 기저막으로 내층과 분리되어 있으며, 배아체 내층의 세포는 원주상피입니다. 형태학적으로 내층은 많은 분열 세포를 포함하고 있지만, 미분화된 배아줄기세포 군집과 더 유사합니다.

인간 배아줄기세포의 특성

호메오시스 유전자 차단을 배경으로 실질-중간엽 신호전달 상호작용의 부재는 배양 시 배아줄기세포의 무질서한 성장을 초래하는데, 이는 임시 장기의 기반 구조 형성 및 발달을 방해하기 때문이다. 배양 시 배아줄기세포의 무질서한 성장과 무질서한 자발적 분화는 미래 장기의 기질 골격에 중간엽 표지가 없기 때문이다. 시험관 내에서는 수백만 개의 간세포를 형성하는 것이 가능하지만, 부비동, 디세 공간, 쿠퍼 세포와 같은 구조적 및 기능적 요소를 포함하는 단일 간소엽을 얻는 것은 불가능하다.

배아줄기세포의 다능성은 배아의 조직과 기관이 형성되는 배아발생 과정에서만 실현되는 것으로 여겨지며, 태반과 탯줄은 영양막에서 유래된 것으로 여겨진다. 영양외배엽막에 둘러싸인 배아줄기세포는 노크테요프의 체적 지형 매트릭스의 조합 mRNA를 통해 발달 프로그램을 실행하는 임시 세포 클론을 순차적으로 생성한다. 이 클론은 임시 및 최종 기관의 공간적 배열, 모양 및 크기, 세포 수, 그리고 실질의 구조적 및 기능적 단위로의 조립을 미리 결정한다. 동시에, 배아줄기세포는 그 효능을 구현하는 분자적 기전이 유전적 발달 프로그램과 완전히 분리된 유일한 세포 유형으로 남아 있으며, 수용체 인식 및 신호전달 체계 차단으로 인해 배아줄기세포 자체가 다른 세포와 상호작용할 수 없다. 그러나 배아줄기세포(ESC)의 적절한 활성화는 배아발생 프로그램의 단계적 발전으로 이어지고, 자궁 외 생활을 위한 준비가 된 수십억 개의 세포로 구성된 완전한 형태의 유기체 탄생으로 끝납니다. 세포 공간에서의 이러한 단기적이지만 상상할 수 없을 만큼 장기적인 경로에서, 세포의 생명 활동을 보장하는 분자적 기전과 세포의 증식, 분화, 그리고 특수화를 제어하는 프로그램 모두에서 필연적으로 오류가 발생합니다. 따라서 현대 약물유전학에서는 분자 구조 질환과 세포 프로그래밍 질환을 별도로 고려합니다. 더욱이, 대부분의 신약은 분화, 증식, 기관형성 프로그램의 교정과 장기 및 조직의 재생을 목표로 합니다. 성체에서 배아줄기세포는 뇌, 간, 비장, 골수 및 기타 인체 장기에 이식된 줄기세포/전구세포의 행동을 제어하여, 보존된 중간엽 기질에서 공여 세포를 분화 및 특수화함으로써 수혜자 장기의 손상된 실질을 회복할 수 있도록 합니다. 본질적으로, 전능성 프로그램은 난모세포, 접합자, 그리고 할구 유전체 수준에서 실현되기 시작합니다. 그러나 이러한 세포들은 아직 실험 및 실제 의학에 필요한 양만큼 복제 및 계대 배양되지 않았습니다. 따라서 배아줄기세포는 배아의 3차원 지도를 위한 코드와 낭배 형성 중 특수 세포주의 선형 제한을 위한 코드를 포함하는 고유한 유전 정보원으로 남아 있습니다.

배아줄기세포(ESC)의 사실상 무한한 재생 잠재력은 분화된 체세포의 유전 장치와 달리 유전체가 다능성을 유지하기 때문입니다. 배아줄기세포에 내재된 유전 정보가 휴면 상태에 있는 것 중 하나는 소위 최소 표현형입니다. 즉, 배아줄기세포 표면에 발현되는 수용체의 수가 제한되어 있어 세포 핵 장치와 미세환경의 상호작용에 사용되는 신호 전달 프로그램이 매우 적습니다. 특수 세포주와 세포 분화를 제한하는 유전자들이 동면 상태에 있는 상황에서, 500개의 유전자 중 약 30개만 활성화되며, 이 유전자들의 산물은 세포와 주변 미세환경의 연결을 보장합니다. 유전자 발현의 연속 분석법을 이용하여, 체세포와 배아줄기세포에서 에너지와 대사를 조절하는 유전체의 주요 기능 상자들의 공통적인 작용으로 인해, 후자는 수용체, G 단백질, 이차 전달 인자, 전사효소, 발현 및 억제 보조 인자, 즉 조절 신호의 세포막 관통 전달 시스템 전체의 mRNA 수준이 매우 낮음을 확인했습니다. 이는 전달 신호 유전자의 발현이 없거나 매우 낮기 때문입니다. 배아줄기세포 유전체의 유도 분화 기간 동안, 세포 접착 수용체, 세포외 기질 구성 요소, 제한 전사효소, 그리고 세포질막 수용체에서 핵 장치로 신호 전달 시스템의 전달 인자의 합성을 제어하는 61개의 전달 신호 유전자의 활성화를 배경으로, 18개의 기능 유전자가 동시에 작동을 멈춥니다. 동시에, 침묵 단백질 합성을 담당하는 유전자의 발현과 배아줄기세포 유전체의 전능성을 보장하는 유전자 발현 보조 억제제의 발현도 차단됩니다.

세 배엽 세포 모두에서 유전자 마커가 발견되었습니다. 외배엽 세포층은 nodal, oct3, fgf-5 유전자의 발현을 통해, 중배엽 세포층은 brachyury, zeta-globin 유전자의 발현을 통해, 내배엽 세포층은 gata-4 유전자의 발현을 통해 식별됩니다. 정상적인 배아 발생 과정에서는 낭배 형성기 동안 미성숙 줄기세포 및 전구세포 집단의 활발한 이동이 관찰되며, 두개골 안면골, 뇌 일부, 말초신경계, 심장 전도계, 흉선의 발달 영역을 국소적으로 표시하는데, 이러한 조직은 이동 세포 클론으로 형성됩니다. 배엽 초기 유전자에 의한 세포 표시는 발생 중인 배아에서 전구세포의 이동 과정에 대한 지형학적 분석을 용이하게 합니다. 특히 P19 배아암 세포 응집체에서 첫 번째 중배엽 유전자인 brachyury의 발현은 조직 플라스미노겐 활성제, 알파-태아단백질, 케라틴 8 및 케라틴 19 유전자의 발현 감소 시기에 시작되는데, 이 유전자들은 첫 번째 중배엽 이동 개체군의 표지자입니다. 따라서 중배엽 기원 조직의 형성은 중배엽 전구 세포의 점 이동 및 분산 과정이 완료된 후에야 시작됩니다.

극히 제한적인 표현형 특징과 대부분의 트랜스 신호 전달 단위의 부재에도 불구하고, 배아줄기세포(ESC)는 여전히 식별에 사용될 수 있는 일부 수용체 분자를 발현합니다. 인간과 영장류에서 ESC 마커 항원이 흔하게 발견된다는 점은 주목할 만합니다. 막 결합 항원 SSEA-3, SSEA-4(당지질 GL7과 시알산의 복합체를 나타내는 고유 지질 항원)와 고분자 당단백질 TRA-1-81, TRA-1-60에 대한 표지 항체가 ESC 표지에 가장 흔히 사용됩니다. 또한, ESC는 특정 배아 항원 SSEA-1과 내인성 알칼리성 인산분해효소, 그리고 특정 전사인자 Oct4를 발현합니다. Oct4는 ESC 증식 기전을 유지하는 데 필수적입니다. 특정 전사인자 Oct4는 섬유아세포 성장 인자 4 유전자의 발현을 활성화하고 미성숙 세포에서 무한한 DNA 복제를 담당하는 유전자 상자의 발현을 안정화시킵니다. 가장 중요한 세포 내 표지 단백질은 크로마틴 침묵 단백질과 관련된 Oct3, Oct4, Tcf 및 Groucho입니다.

수년간의 체외 배아줄기세포 배양 시도가 성공하고 마우스 배반포에서 분리된 줄기세포와 일차 생식세포 배양이 최초로 이루어진 직후, 배아줄기세포의 다능성 잠재력에 대한 연구가 초기 발달 단계의 배아에 도입되면서 시작되었습니다. 상실배와 배반포 단계에서 배아줄기세포는 모든 체세포 조직과 심지어 생식세포에서도 공여 배아줄기세포의 후손이 검출되는 키메라 배아를 형성할 수 있음이 밝혀졌습니다. 따라서 발생생물학에서 배아줄기세포를 이용한 생체 내 실험과 시험관 내 실험 사이에 "다리"가 형성되었고, 이는 일차 조직 및 기관의 형성 과정, 분화, 그리고 배아 기관 형성에 대한 연구 가능성을 크게 확대했습니다.

배아 발생 과정에서 배아줄기세포(ESC)가 초기 배아의 세포 덩어리에 통합되고, 그 유도체가 모든 장기와 조직에서 발견된다는 것은 생체 내에서 명확하게 입증되었습니다. ESC는 키메라 배아에서 생식 세포 계통을 형성하며, 이 생식 세포 계통의 후손은 완전한 난자와 정자를 형성합니다. 배아줄기세포는 클론원성(clonogenic)을 지닙니다. 즉, 단일 ESC는 oct4 유전자와 알칼리성 인산분해효소의 발현, 높은 텔로머라제 활성, 그리고 특정 배아 항원의 발현을 포함하는 분자 마커를 가진 유전적으로 동일한 세포 군집을 형성할 수 있습니다.

배아줄기세포를 이용한 배아발생 기전을 연구하기 위해, 외부에 수용자 사배체 할구층이 있는 생물학적 구조물을 만들고, 내부에 공여 배아줄기세포를 도입하는 상실배 키메라화 방법을 개발했습니다. 이렇게 하면 수용자 사배체 할구의 후손으로부터 영양막이 형성되어 착상과 태반 형성이 보장되고, 공여 배아줄기세포는 생존 가능한 배아의 본체와 일차 전구 생식 세포 계통을 형성하는 내부 세포 덩어리 역할을 합니다. 배아줄기세포의 연구적 가치는 유전체 조작 과정에서 만능성이 보존될 뿐만 아니라, 키메라 배아의 일차 생식 세포 형성에 참여하는 능력도 보존된다는 점에 있습니다. 유전자 변형된 배아줄기세포 하나의 후손만으로도 8세포 배아와 이 세포를 응집시키거나 공동 배양하여 얻은 키메라 배아의 모든 일차 발달 단계와 발달 조직을 채울 수 있다는 것이 밝혀졌습니다. 녹색 형광 단백질 유전자를 형질감염시킨 배아줄기세포(ESC)를 생쥐의 상실배(morula)에 이식했을 때, 이 세포의 형광 후손들이 발생 중인 배아의 모든 연구 조직에서 발견되었습니다(Shimada, 1999). 상실배에 ESC를 이식하면 공여된 ESC의 후손만으로 구성된 생존 가능한 생쥐를 만들 수 있으며, 이는 치료적 복제를 위한 다양한 옵션의 가능성을 열어줍니다. 이 방법론적 접근법은 현재 발생생물학의 문제, 특히 X 염색체의 유전적 불활성화 또는 ESC의 후성유전학적 불안정성 메커니즘을 분석하는 데 성공적으로 사용되고 있습니다. 초기 배아에 ESC를 이식하는 것은 농업 생명공학뿐만 아니라 유전자 치료 실험에도 활용됩니다.

유전자 변형 배아줄기세포(ESC) 이식은 돌연변이 유전자의 표적 세포를 검사하는 데 사용됩니다. 시험관 배양된 ESC는 생명공학 분야에서 녹아웃 마우스 제작에 사용됩니다. 이를 위해 연구 대상 유전자를 상동 재조합(녹아웃)을 통해 ESC에서 제거하고, 이 유전자가 결핍된 세포를 선택 배지에서 분리합니다. 녹아웃된 ESC는 배반포에 도입되거나 상실배아 할구와 함께 응집됩니다. 이렇게 얻어진 키메라 초기 배아는 수혜자 암컷에게 이식되고, 신생 마우스 중에서 특정 유전자에 대해 무접합성(nullizygous) 생식세포를 가진 개체를 선별합니다. 이 기술은 실험 생물학 및 실험 의학 분야에서 널리 사용되는 다양한 녹아웃 마우스 계통을 만드는 데 사용되었습니다. 이러한 생물학적 모델은 배아 발달에서 특정 유전자의 중요성과 인간 질병 및 병리학적 상태의 메커니즘에서의 역할을 연구하는 데 사용됩니다. 또한, 녹아웃 동물 계통은 새로운 유전자 치료 방법의 전임상 시험에도 사용됩니다. 예를 들어, 돌연변이 유전자의 정상 대립유전자를 배아줄기세포(ESC) 게놈에 형질전환시킴으로써 조혈계에 영향을 미치는 돌연변이를 효과적으로 교정할 수 있습니다. 외래 유전자를 배아줄기세포에 도입하면 동형접합 형질전환 실험동물을 신속하게 생산할 수 있습니다. 그러나 표적 재조합 유전자 삭제 기술은 현재까지 마우스 배아줄기세포와 관련하여서만 신뢰성 있게 개발되었다는 점에 유의해야 합니다. 이중 녹아웃 마우스 배아줄기세포를 이용하여 7번 염색체 유전자 클러스터 영역(인간 19번 염색체 게놈 영역의 사본)과 11번 염색체 근위 영역(인간 5g 염색체의 사본)의 기능적 역할을 규명했습니다. 마우스 배아줄기세포에서 이러한 유전자를 삭제함으로써 인간에서 유사체의 기능을 평가할 수 있었습니다.

인간 배아발생 유전자의 기능 연구 가능성이 확대되었으며, 특히 실험실 동물의 배아줄기세포 유전체에 유전자를 형질전환함으로써, 눈 배아발생에서 심장형성 중배엽의 형성 및 발달에 관여하는 암호유전자(cryptogene)인 pax-6 유전자의 역할을 규명할 수 있었습니다. 기형암종 및 생쥐 배반포의 미성숙 증식 배아줄기세포에서 유전자 발현 지도가 최초로 작성되었으며, 배아줄기세포에서 신호전달 유전자의 억제 작용이 확인되었습니다. 60~80개의 돌연변이 배아줄기세포와 20~30개의 정상 착상 전 생쥐 배아세포를 조합하여, 기관 원기가 공여 세포와 수용 세포로 구성된 키메라 배아를 개발하였고, 이를 통해 낭배형성 및 기관발생에서 미지의 유전자의 역할을 규명할 수 있었습니다. 발달 중인 마우스 배아의 유전자 기능 지도는 부신과 생식선 형성에 있어서 sf-1 유전자의 역할, 신장 형성에 있어서 wt-1 유전자의 역할, 골격근 형성에 있어서 myoD 계열의 유전자, 적혈구 생성과 림프구 생성의 기초적인 성숙에 있어서 gata-1-4 계열의 유전자의 역할에 대한 정보로 보완되었습니다.

벡터 재조합효소를 이용하여 배아줄기세포에서 모계 및 부계 대립유전자의 직접적인 스위치 오프를 통해 배아발생 초기 단계에서 다양한 유전자의 기능을 규명할 수 있었으며, 미지의 인간 유전자를 마우스 배아줄기세포로 직접 전이하는 기술은 심각한 유전병의 발병을 담당하는 새로운 돌연변이 유전자의 발견에 기여한다. 녹아웃 방법을 이용하여 배아 조직 형성에 필수적인 유전자들의 중요성을 규명하였다. gata-4는 심근을 담당하고, gata-1은 조혈 조직의 적혈구 계통을 담당하며, myoD는 골격근을 담당하고, brachyury는 중배엽을 담당하며, 제한효소 hnf3와 hnf4는 간줄기세포를 담당하고, rag-2는 T 및 B 림프구 클론 형성을 담당한다(Repin, 2001). 배아줄기세포(ESC)에서 유전자의 이중 결실은 생식층 유전자의 기능적 역할, 분화 및 동종성(homeosis) 연구에 대한 가능성을 열었으며, ESC 이식을 통해 생존 가능한 종간 잡종 배아를 얻을 수 있게 되었습니다. 단일 기증 ESC를 8세포 배아에 이식하는 개선된 기술을 사용하여 수용자 배아의 여러 장기가 세포 수준에서 키메라화된다는 사실이 입증되었습니다. 인간 조혈줄기세포를 배반포에 도입한 후 수용자 마우스의 장기에서 인간 조직의 세포 싹이 발견되었다는 점에 주목해야 합니다. 장기 형성 기간 동안 마우스 배아의 혈액을 통해 만능 ESC가 순환한다는 것이 밝혀졌습니다. ESC의 생물학적 기능은 미래 면역 체계의 배아 조직화에 있을 가능성이 있습니다. 배아줄기세포(ESC)의 도움으로 실험실 환경에서 인간 유전병리의 적절한 모델이 재현되었습니다. 쥐에서 디스트로핀 유전자를 이중으로 녹아웃시킨 뒤, 뒤센 근이영양증 모델을, 염색질 신호 키나아제 합성을 제어하는 atm 유전자를 정지시킨 모세혈관확장증 모델을 재현했습니다. 이 치명적인 소아 유전 질환은 DNA 복구 결함으로 인해 소뇌의 푸르키네 세포가 퇴화되고, 증식하는 세포의 사멸로 인해 흉선이 퇴화됩니다. 키메라 마우스에서 ESC에 병리학적 유전 정보를 도입하여 재현한 모세혈관확장증의 임상 양상, 병태생리 및 병태 형태는 인간의 그것과 일치합니다. 운동실조-텔란그렉타시아 외에도 ESC와 녹아웃 마우스를 사용하여 탄수화물 및 지질 대사, 아미노산 분해, 구리 및 빌리루빈 배설과 관련된 일부 유전적 동형 접합체 인간 질병에 대한 실험 모델이 개발되었으며, 이를 통해 해당 인간 질병을 치료하는 새로운 방법을 전임상 시험하는 단계에서 실험 의학의 역량이 크게 확장되었습니다.

[ 12 ], [ 13 ], [ 14 ], [ 15 ]

줄기세포 세포 하이브리드의 활용

배아줄기세포와 체세포를 융합하여 얻은 잡종 세포는 줄기세포의 다능성 연구와 분화된 세포의 염색체 재프로그래밍에 적합하고 유망한 모델입니다. 성체 동물의 분화된 세포와 배아줄기세포를 융합하여 얻은 세포잡종 세포는 서로 다른 "연령"의 유전체 간의 관계를 연구할 수 있게 합니다. 서로 다른 분화 단계와 성숙도에 있는 세포에서 유래한 상동 염색체가 동일한 핵에 위치하여 트랜스 작용 조절 신호를 쉽게 교환할 수 있는 독특한 상황이 발생합니다. 개체 발생 과정에서 형성되는 상동 염색체의 시스 조절 후성유전학 시스템이 배아 관련 유전체에서 나오는 트랜스 작용 신호의 영향에 어떻게 반응할지 예측하기는 어렵습니다. 또한, 잡종 세포에서는 부모 염색체의 분리가 일어나므로, 개별 염색체 수준에서 유전체의 상호작용을 연구할 수 있습니다. 즉, 다능성을 유지하는 데 특정 염색체가 관여하는지, 아니면 반대로 분화로의 이탈이 있는지 잠재적으로 확인할 수 있습니다.

다능성 기형암종과 분화된 체세포를 융합하여 얻은 세포잡종은 서로 다른 "발달 이력"을 가진 유전체의 상호작용을 연구하는 최초의 실험 모델로 사용되었습니다. 어떤 경우에는 이러한 잡종 세포가 상당히 높은 수준의 다능성 특성을 유지했습니다. 특히, 생체 내 기형암종-체세포 잡종 세포는 세 배엽 모두의 유도체를 포함하는 진정한 기형종의 발생을 유도했으며, 시험관 내 현탁 배양에서 배아체를 형성했습니다. 이러한 유형의 종간 세포잡종에서도 기형암종 세포와의 융합에서 체세포 파트너가 림프구 또는 흉선세포인 경우 배아 항원의 존재가 관찰되었습니다. 기형암종 세포와 섬유아세포를 융합하여 생성된 세포잡종은 표현형이 섬유아세포와 일치한다는 점이 주목할 만합니다.

가장 중요한 확립된 사실은 기형암종-체세포 교잡 세포에서 분화된 세포 유전체의 재프로그래밍 징후가 나타났으며, 이는 개별 유전자 또는 체세포 파트너의 비활성 X 염색체의 재활성화를 특징으로 한다는 것입니다. 따라서 기형암종-체세포 유형의 세포 교잡 세포에 대한 연구 결과는 교잡 세포에서 다능성이 종종 보존되며 체세포 파트너 유전체의 재프로그래밍 징후가 있음을 시사합니다.

마우스 배아줄기세포와 성체 비장세포를 융합하여 종내 배아 잡종 세포를 얻는 실험에서, 이러한 세포잡종 세포의 특성을 연구하고, 부모 염색체의 분리를 분석하며, 잡종 유전체의 다능성을 평가했습니다. 기형암세포와 체세포를 융합하여 얻은 종내 잡종 세포는 일반적으로 낮은 수준의 염색체 분리를 특징으로 하며, 사배체 또는 거의 사배체 핵형을 보입니다. 일차 생식세포와 림프구를 융합하는 동안 세포잡종 세포에서도 유사한 염색체 구성이 관찰되었습니다. 동시에, 마우스 기형암세포와 밍크 림프구를 융합하여 얻은 종간 잡종 세포는 체세포 파트너의 염색체가 심하게 분리되었습니다.

중합효소 연쇄 반응을 사용하여 마이크로위성체를 분석하는 방법이 개발되면서, 종내 잡종에서 부모 염색체의 분리에 대한 연구가 질적으로 새로운 단계로 접어들었습니다. 이 방법을 통해 각 마우스 염색체에서 수백 개의 마커가 발견되었고, 잡종 세포에서 상동 염색체 쌍을 신뢰성 있게 구별할 수 있게 되었습니다.

ESC(히폭산틴 포스포리보실트랜스퍼라제 활성이 결핍된 HM-1 세포, 2n = 40, XY, 129/01a 마우스의 배반포에서 분리)를 동종 DD/c 마우스의 비장세포와 융합시켜, ESC와 형태적으로 유사한 하이브리드 클론 세트를 얻을 수 있었습니다. 모든 클론은 히폭산틴 포스포리보실트랜스퍼라제가 활성인 세포만 자랄 수 있는 선택 배지에서 분리했습니다. 전기영동 분석 결과, 모든 클론은 DD/c 마우스의 특징인 히폭산틴 포스포리보실트랜스퍼라제의 대립유전자 변이를 가지고 있는 것으로 나타났습니다. 세포유전학 분석 결과, 4개의 하이브리드 클론 중 3개가 거의 이배체 염색체 세트를 가지고 있는 것으로 나타났습니다. 거의 사배체인 클론 하나에는 하이브리드 세포 집단이 두 개 있었는데, 그 중 하나는 사배체였고 두 번째, 더 작은 클론은 이배체였습니다.

거의 이배체 세트를 갖는 잡종 클론에서 마우스 129/01a와 DD/c의 상동 염색체 쌍을 구별할 수 있는 미세위성 분석 결과, 두 클론에서 체세포 파트너의 상염색체가 명확하게 우선적으로 제거됨을 보여주었습니다. 클론 HESS2와 HESS3의 대부분의 상염색체는 다능성 파트너인 129/01a 계통의 마커를 가지고 있었습니다. 예외는 염색체 1과 I였습니다. 클론 HESS2와 HESS3에서 HM-1 세포의 마커와 함께 체세포 파트너의 마커가 소량 존재했습니다. 이러한 결과는 체세포 파트너의 염색체 1과 I의 불완전한 분리를 반영할 수 있으며, 클론 HESS2와 HESS3 세포의 30-40%에서 이러한 염색체의 삼염색체성이 관찰된다는 세포유전학 데이터와 일치합니다. 클론 HESS4는 염색체 구성에 있어 상당한 차이를 보였습니다. 이 클론의 많은 상염색체는 ESC 유전체(2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 13, 14, 17번 염색체)에서 유래했지만, 1, 9, 11, 12, 15, 16, 18, 19번 염색체는 양쪽 부모의 상동 염색체로 나타났습니다. 이러한 상동 염색체를 표시하는 미세위성체의 정량적 비율은 약 1:1이었습니다. 이를 통해 저자는 한 상동 염색체는 ESC 유전체에서 유래했고 다른 상동 염색체는 분화된 세포에서 유래했다고 추정할 수 있었습니다. 클론 HESS4의 일부 하위 클론에서는 체세포 파트너의 18번 염색체와 19번 염색체의 마커만 존재했습니다. 얻어진 결과는 HESS4 클론의 세포에서 체세포 파트너의 염색체 분리 외에도 다능성 유전체의 위에 나열된 염색체의 하나 또는 두 개의 상동체가 제거되었다는 것을 보여줍니다. 즉, 두 부모의 염색체가 양측에서 분리되었습니다. 이는 매우 이례적인 현상인데, 부모 중 한 쪽의 염색체만 분리되는 것은 세포 잡종의 특징이기 때문입니다.

또한, 20번째 계대 이후, 모든 잡종 세포 클론은 체세포 파트너의 X 염색체의 마커만 포함했습니다.즉, ESC X 염색체는 클론에서 체세포 파트너의 X 염색체로 대체되었습니다.이 중요한 사실은 마우스 X 염색체에 특이적인 FITC 표지 프로브를 사용한 현장 교잡화 데이터로 확인되었습니다.양성 신호는 한 염색체에서만 검출되었습니다.세포 유전학 데이터에 따르면 배양 초기 단계(15번째 계대 이전)에서는 많은 세포가 두 개의 X 염색체를 포함하고 있었습니다.따라서 선택 배지를 사용하면 잡종 세포의 염색체 구성을 조작하고 ESC 게놈의 배경에 대해 체세포 파트너의 단일 염색체를 운반하는 클론을 선택적으로 선택할 수 있습니다.

세포혼성체 유전체의 독특한 특징은 모체 유전체가 한 핵에 위치한다는 점이므로, 분화된 세포의 유전체와 밀접하게 접촉하는 조건 하에서 배아줄기세포-체세포 잡종체에서 배아 유전체의 다능성 특성이 어떻게 보존되는지에 대한 의문이 자연스럽게 제기됩니다. 형태학적으로, 배아줄기세포와 체세포의 세포혼성체는 모체 배아줄기세포와 유사했습니다. 다능성 평가 결과, 거의 이배체에 가까운 염색체 세트를 가진 모든 클론은 세 개의 배엽의 유도체가 존재하는 현탁 배양에서 배아체를 형성할 수 있는 것으로 나타났습니다.

대부분의 하이브리드 세포는 초기 마우스 배아의 특징적인 마커인 ECMA-7 항원을 함유했으며, 높은 알칼리성 인산분해효소 활성도 가지고 있었습니다. 하이브리드 세포의 높은 다능성에 대한 가장 설득력 있는 데이터는 HESS2 클론의 하이브리드 세포를 이용한 일련의 주입 키메라를 얻는 실험에서 얻어졌습니다. 생화학적 마커 분석 결과, 공여자 하이브리드 세포의 후손이 키메라의 대부분 조직에 존재하는 것으로 나타났습니다. 따라서 배아줄기세포와 체세포 분화 세포를 융합하여 얻은 하이브리드 세포는 배반포강에 주입했을 때 키메라를 형성하는 능력을 포함하여 높은 수준의 다능성을 유지합니다.

클론 HESS2와 HESS4는 부모 염색체의 구성에서 상당한 차이를 보였지만, 유사한 다능성 특성을 가지고 있었습니다. 잡종 유전체의 다능성은 우성 형질로 나타난다고 가정할 수 있지만, 배아 유전체의 모든 염색체가 다능성 유지 과정에 관여하는 것은 아닐 수도 있습니다. 이 가정이 맞다면, 잡종 세포의 유전체에서 다능성 파트너의 일부 염색체가 제거되어도 다능성 상태의 변화는 나타나지 않을 것으로 예상할 수 있습니다. 이 경우, 배아 잡종 세포에서 부모 염색체의 분리 분석을 통해 배아 세포의 다능성 조절을 담당하는 염색체를 식별하는 데 더욱 근접할 수 있을 것입니다.

O. Serov 등(2001)은 129/01a 마우스 유전자형을 가지고 DD 마우스의 X 염색체를 보유한 정상 마우스와 키메라를 교배하여 얻은 50마리의 자손 중 어떤 자손도 발견하지 못했습니다. 저자들은 이것이 체세포 유전체의 영향으로 잡종 세포의 다능성이 감소했기 때문이라고 생각합니다. 또 다른 설명은 감수 분열 중 일부 상염색체에 대한 삼염색체성의 부정적인 영향과 잡종 세포의 성염색체 불균형(XXY는 15번째 계대까지 세포에서 관찰됨)일 수 있습니다. XXY 세포는 감수 분열을 거쳐 생식 세포를 형성할 수 없는 것으로 알려져 있습니다. 삼염색체성은 또한 잡종 세포의 증식 활성을 감소시킬 수 있으며, 그 결과 키메라 발달의 선택적 이점은 수용자 배아의 세포에 속할 수 있습니다. 따라서 잡종 세포의 다능성 잠재력을 적절히 평가하려면 정상적인 이배체 염색체 세트를 갖춘 잡종 클론을 확보해야 합니다.

O. Serov와 공동 저자(2001)의 실험에서, 하이브리드 세포의 유전체에서 체세포의 X 염색체를 재프로그래밍할 가능성이 처음으로 입증되었습니다. 저자의 이러한 결론은 키메라에서 hprt 유전자(X 염색체 마커)의 발현을 분석한 결과에서 비롯됩니다. DD/c 마우스의 hprt 대립유전자 변이가 분석된 모든 키메라 조직에서 검출되었습니다. 하이브리드 세포를 배반포강에 도입한 후, 세포 하이브리드는 비선택적 조건에 빠지고 하이브리드 세포의 유전체에서 X 염색체가 보존된다는 것은 X 염색체가 하이브리드 세포의 필수 구성 요소가 되었으며 유전체가 다능성 파트너의 Y 염색체와 구별하지 않는다는 것을 강조하는 것이 적절합니다.

혼성 배아 세포에서 체세포 유전체와 다능성 유전체의 상호작용 분석 결과를 요약하면, 저자들은 일부 세포혼성체에서 다능성이 우성 형질로 발현된다는 결론을 내렸습니다. 혼성체 유전체는 분화된 세포의 개별 염색체를 재프로그래밍할 수 있지만, 체세포 유전체가 배아 유전체의 다능성에 미치는 역효과를 배제하지는 않습니다. 혼성체 세포를 배양할 때, 배아줄기세포 HM-1의 원래 모계보다 분화 유도가 훨씬 더 빈번하게 발생합니다. 1차 콜로니 형성 과정에서도 유사한 효과가 관찰됩니다. 배아 혼성체의 많은 1차 콜로니는 형성 초기 단계에서 분화하며, 선택 및 번식 과정에서 클론이 대량 소실됩니다.

따라서 배아줄기세포와 체세포의 융합으로 생성된 세포혼성체는 분화된 세포의 유전체와 밀접하게 접촉함에도 불구하고 배아 유전체의 고유한 특성인 다능성을 유지합니다. 더욱이, 이러한 혼성체 세포에서는 분화된 세포에서 유래한 개별 염색체의 재프로그래밍이 가능합니다. 배아 유전체의 다능성 특성, 특히 키메라에서 생식 세포 형성에 참여하는 능력이 혼성체 세포에서 어느 정도까지 유지되는지는 아직 불분명합니다. 이를 위해서는 정상 핵형을 가진 배아 혼성체 세포를 확보해야 합니다. 어떤 경우든, 다능성 배아 혼성체 세포는 부모 염색체의 양측 분리가 잠재적으로 그러한 기회를 제공하기 때문에 다능성 유지 또는 조절에 관여하는 염색체를 식별하는 데 실질적인 유전적 모델이 될 수 있습니다.

O. Serov 등(2001)이 "염색체 기억"이라고 정의한 현상에 대한 연구 또한 마찬가지로 매력적입니다. 하이브리드 게놈에서 상동 염색체는 두 가지 다른 형태를 갖습니다. 체세포 파트너의 상동 염색체는 이미 분화를 경험한 반면, 다능성 파트너의 상동 염색체는 이 과정이 막 시작된 상태입니다. 결과적으로, 하이브리드 세포가 높은 다능성 특성을 유지하는 것은 체세포 파트너에서 유래하는 전사 인자의 영향에도 불구하고 ESC 상동 염색체의 "다능성" 형태가 하이브리드 게놈에서 충분히 안정적임을 시사합니다. 키메라 발생 과정에서 분화된 게놈의 상동 염색체가 재프로그래밍되는 위에서 설명한 징후는 세포 하이브리드 형성 및 배양 초기 단계에서 생체 내 분화 과정에서 획득한 상태를 유지할 가능성을 배제하지 않습니다. 최근 얻은 데이터에 따르면, 배아 잡종 세포를 비선택적 환경으로 이식했을 때 체세포 파트너의 염색체만 집중적으로 제거되는 것으로 나타났습니다. 즉, 잡종 세포의 유전체는 10~15회 계대 배양 후 상동 염색체를 쉽게 구별합니다. 따라서 배아 잡종 세포는 배아 유전체의 근본적인 특성인 다능성뿐만 아니라 그 대안인 배아 분화를 연구하는 데 유망한 실험 모델이 될 수 있습니다.

배아줄기세포 이식의 치료 효능

배아줄기세포(ESC)와 그 유도체 이식의 치료 효능을 분석하기에 앞서, 위 자료를 요약합니다. 시험관내 배아발생을 완전히 구현하는 측면에서 ESC의 능력은 충분하지 않습니다. 이 경우 발달 결함은 체내에서 ESC와 독립적으로 발생하는 중간엽 줄기세포의 부재에 기인하기 때문입니다. ESC의 유전적 잠재력은 접합자의 유전적 잠재력보다 낮기 때문에 배아 복제에 직접적으로 사용되지 않습니다. 발달 프로그램이 일관되게 완벽하게 구현되는 유일한 세포로서 ESC의 고유한 생물학적 잠재력은 유전자 기능 연구에 활용됩니다. ESC의 도움으로 3배엽 발달을 암호화하는 초기 및 후기 유전자의 발현을 활성화하는 신호의 첫 번째 조합이 해독됩니다. 시험관내에서 ESC 유전체의 다능성이 보존되어 있기 때문에, ESC는 장기 및 조직 손상 시 세포 손실을 자동으로 보충할 수 있는 회복 재생을 위한 고유한 도구입니다. 이상적인 가상 시나리오에서는 "... 기증자 배아줄기세포를 이식할 때, 밀집된 프로그램이 수용자의 신체로 전달되고, 유리한 조건 하에서 새로운 조직이 구성되며, 이는 '... 형태적, 기능적 수준 모두에서 수용자의 신체에 효과적으로 통합될 수 있다'고 가정할 수 있습니다."

자연스럽게 배아줄기세포(ESC)의 단일 분화 방법 개발에 따라, 하나의 특화된 클론에서 시험관 내에서 얻은 세포의 기능적 활성에 대한 생체 내 연구가 시작되었습니다. 증식하는 ESC 클론은 수혜 조직 손상 부위에 적극적으로 통합될 수 있는 이동성 전구 세포 집단을 생성하며, 이는 재생 가소성 의학에 사용됩니다. DOPA 뉴런을 흑질에 이식하면 실험적 편측파킨슨병의 임상 증상이 감소하는 것으로 밝혀졌습니다. 기증자 신경줄기세포의 국소 이식은 척수와 뇌의 외상이나 타박상으로 인한 운동 장애의 정도를 감소시킵니다. 탈수초성 질환에 대한 줄기세포 이식의 첫 번째 긍정적인 결과도 얻어졌습니다. ESC의 재생 가소성 잠재력은 실제 의학에서 세포 이식의 무한한 가능성을 열어줄 것으로 보입니다. 그러나 이소성 부위에 이식될 경우, ESC는 불가피하게 종양으로 변형됩니다. 기형종은 배아줄기세포(ESC)를 면역결핍 마우스의 피하 주사로 주입할 때 형성됩니다. 동계 마우스의 고환낭 아래에 ESC 현탁액을 이식할 때도 세 배엽 모두에서 유래된 세포로 구성된 다양한 조직으로 구성된 기형종이 형성됩니다. 이러한 기형종에서 기관형성 감소 과정은 매우 드뭅니다.

여러 연구에서 초기 배아줄기세포(ESC) 유도체를 실험적 병리학적 특징을 가진 동물에 이식한 결과의 긍정적 결과에 대한 정보를 제공합니다. 배아줄기세포 유도체를 이용한 세포 신경이식은 뇌 및 척추 손상의 기능 장애를 교정하고 척수공동증과 다발성 경화증을 치료하기 위한 실험 및 최초의 임상 시험을 통해 더욱 발전하고 있습니다(Repin, 2001). 배아줄기세포를 이용한 시험관 내 신경발생 기술의 도래와 함께, 배아 뇌 조직을 사용하는 대신 배아 신경 조직 배양에서 얻은 신경구 유도체를 이식하는 방법이 개발되고 있습니다. 이러한 이식 현탁액은 훨씬 더 균질하며 뉴런과 신경아교세포의 전구체를 포함하고 있습니다.

인간 배아-(기형)암 세포주 NTERA-2에서 10μg/ml의 레티노산을 6주 동안 정기적으로 첨가하면, 세포 분열 후 신경 세포의 80% 이상이 형성됩니다. 면역 표현형 마커로 표지된 성숙 신경 세포를 유동 분류하여 신경 세포 집단의 완전한 동질성을 확보함으로써 기형암 세포 및 미성숙 세포의 잔여물을 제거할 수 있습니다. 실험 동물의 뇌 여러 영역에 이식하면, 이러한 신경 세포는 생존할 뿐만 아니라 국소 신경망에 통합됩니다. 국소 중추신경계 결함의 실험 모델을 가진 동물에서, 신경 이식은 외상성 뇌 손상, 뇌졸중, 탈수초성 질환, 소뇌 발달의 유전적 결함, 지질 및 다당류 침착 질환과 같은 인간 병리의 임상 증상을 감소시킵니다.

중추신경계 퇴행성 질환에서 재생 과정을 최적화하기 위해, 배아줄기세포로부터 미엘린 생성 희소돌기아교세포를 얻는 기술이 개발되고 있습니다. 첫 번째 단계는 전통적으로 배아줄기세포를 증식시켜 이식에 필요한 세포 수를 재생하는 것입니다. 두 번째 단계에서는, 선택적 마커 항원에 의해 조절되는 미엘린 생성 희소돌기아교세포 전구체 집단으로의 세포 분화가 진행됩니다.

흉선 성숙의 유전적 결함으로 인한 면역결핍을 교정하는 방법 개발을 위해 배아줄기세포(ESC) 유도체를 활용할 수 있는 가능성이 열리고 있습니다. TCR 유전자의 V(D)J 유전자좌 재조합 기전의 교란으로 인해 T 림프구 기능이 상실되는 유도 유전자 결함을 가진 녹아웃(rag 1) 마우스를 대상으로 한 연구에서, 초기 ESC 유도체를 동물의 흉선에 이식하면 세포 면역을 담당하는 정상 면역 클론 집단의 성숙이 회복됩니다. 소아의 치명적인 유전성 빈혈 치료를 위해 체외에서 미리 형성된 ESC를 이식하는 임상시험이 진행 중입니다.

줄기세포 이식의 임상적 도입에 대한 반대 의견은 인간 배아줄기세포의 안정적인 세포주 수가 제한적이고 표준화가 필요하다는 데에 근거합니다. 표준화된 배아줄기세포주와 성체 인간줄기세포의 순도를 높이기 위해, 짧은 탠덤 DNA 반복 서열의 분자유전학적 분석을 기반으로 하는 세포주 선별법을 사용하는 것이 제안됩니다. 또한, 세포 배양 조건에서 발생할 가능성이 매우 높은 미세한 염색체 재배열 및 유전적 돌연변이의 존재 여부를 확인하기 위해 배아줄기세포주를 검사해야 합니다. 모든 유형의 배아줄기세포와 국소 다능성 줄기세포의 특성에 대한 의무적 검사에 관한 논문이 제시되었습니다. 이는 시험관 내 증식을 통해 배아줄기세포나 최종 조직에는 내재되어 있지 않은 새로운 특성이 발현될 수 있기 때문입니다. 특히, 사이토카인이 포함된 배지에서 장기간 배양하면 세포주기 조절 경로에서 유사한 변화를 겪고 무한한 세포 분열을 수행할 수 있는 능력을 갖게 되므로, ESC주가 종양 세포에 더 가까워질 것으로 추정됩니다. 일부 저자들은 종양 발생 가능성을 근거로 초기 배아줄기세포 유래물을 인간에게 이식하는 것은 무모한 일이라고 주장합니다. 그들은 배아줄기세포의 확정된 후손, 즉 분화된 세포 전구체를 사용하는 것이 훨씬 더 안전하다고 생각합니다. 그러나 현재로서는 원하는 방향으로 분화하는 안정적인 인간 세포주를 확보하는 신뢰할 수 있는 기술이 아직 개발되지 않았습니다.

따라서 인간 배아줄기세포 유래물 이식의 긍정적인 치료 효과에 대한 데이터가 문헌에 점점 더 많이 등장하고 있습니다. 그러나 이러한 연구 중 다수는 검토 및 비판을 받고 있습니다. 일부 연구자들은 초기 임상 시험 결과가 예비적인 성격을 띠고 있으며, 줄기세포가 특정 질병의 임상 경과에 유리한 영향을 미칠 수 있음을 시사할 뿐이라고 생각합니다. 따라서 세포 이식의 장기적인 결과에 대한 데이터를 확보하는 것이 필수적입니다. 임상 신경이식학의 발전 단계가 논거로 제시됩니다. 실제로 초기에는 파킨슨병에서 배아 뇌편 이식의 높은 효율성에 대한 논문이 문헌에 우세했지만, 이후 환자의 뇌에 이식된 배아 또는 태아 신경 조직의 치료 효과를 부정하는 보고서가 등장하기 시작했습니다.

최초의 임상 시험은 NTERA-2 기형암종 배아줄기세포에서 유래한 신경모세포 이식의 안전성을 평가하기 위해 수행되었습니다. 미성숙 세포는 배양 과정에서 1억 개의 세포 덩어리가 축적될 때까지 증식되었습니다. 이렇게 얻은 세포 중 일부는 표현형을 분석하고 세포 불순물을 확인하며, 바이러스 및 박테리아 오염 가능성을 검사하는 데 사용되었습니다. 태아 기질세포(LIF)와 영양세포층을 배양 배지에서 제거하고, 사이토카인과 성장인자를 조합하여 배아줄기세포를 신경모세포로 표적 분화시키는 조건을 조성했습니다. 그런 다음, 유동 세포 분리기를 이용하여 미성숙 기형암종 세포로부터 신경모세포를 정제했습니다. 이식된 세포의 2차 정제 및 표현형 특성 분석 후, 신경모세포 현탁액(1천만~1천2백만 개)을 특수 마이크로캐뉼라와 주사기를 사용하여 출혈성 뇌졸중 후 7개월째에 환자의 뇌 기저핵에 입체정위 및 컴퓨터 단층촬영(CT)으로 제어하며 주입했습니다. 이식 후 1년간 뇌졸중 부위로의 신경세포 이식 결과에 대한 스크리닝을 실시한 결과, 부작용이나 바람직하지 않은 영향은 발견되지 않았습니다. 환자의 절반은 이식 후 6개월에서 12개월 사이에 운동 기능이 개선되었습니다. 세포 이식 후 긍정적인 임상적 변화와 함께 뇌졸중 부위로의 혈액 공급이 증가했습니다. 양전자단층촬영(PET)에 따르면 형광 표지된 2-디옥시글루코스(2-deoxyglucose)의 흡수가 평균 18% 증가했고, 일부 환자에서는 35% 증가했습니다.

그러나 미국 국립보건원(NIH)은 파킨슨병 환자를 대상으로 신경이식의 임상적 효과에 대한 독립적인 연구를 수행했습니다. 첫 번째 그룹의 환자들은 도파민을 생성하는 배아 신경 조직 절편을 이식받았고, 두 번째 그룹의 환자들은 가짜 수술을 받았습니다. 결과는 도파민을 생성하는 배아 신경 세포가 수혜자의 뇌에서 생존했음에도 불구하고 이러한 신경이식의 임상적 효과는 전혀 없음을 시사합니다. 더욱이, 배아 신경 조직 이식 2년 후 환자의 15%에서 지속적인 운동 이상증이 발생했지만, 위약군에서는 이러한 증상이 나타나지 않았습니다(Stem cells: scientific progress and future research direction. Nat. Inst, of Health. USA). 이 환자들에서 질환의 추가 발생에 대한 관찰은 계속 진행 중입니다.

일부 저자들은 신경 이식의 임상적 효과에 대한 평가에 관한 모순되는 문헌 자료의 원인을 환자 그룹 선택의 차이, 환자의 상태를 객관적으로 평가하는 방법의 부적절한 선택, 그리고 가장 중요하게도 배아 신경 조직의 발달 기간이 서로 다르고 이 조직을 얻은 뇌의 영역이 서로 다르고 이식의 크기가 서로 다르고 수술적 개입의 방법론적 특징이 서로 다르기 때문이라고 주장합니다.

실험적 편측파킨슨병을 앓은 쥐의 뇌 선조체 영역에 만능성 배아줄기세포를 직접 이식하려는 시도는 배아줄기세포의 증식과 도파민 신경세포로의 분화를 동반했다는 점에 주목해야 합니다. 배아줄기세포 이식 후 아포모르핀 검사에서 행동 이상과 운동 비대칭이 교정된 것으로 보아, 새로 형성된 신경세포가 신경망에 효과적으로 통합되었을 것으로 추정됩니다. 동시에, 이식된 배아줄기세포가 뇌종양으로 변형되어 일부 동물이 사망했습니다.

미국 국립 의학 아카데미와 미국 국립 보건원의 전문가들은 배아줄기세포의 임상적 잠재력이 가장 심각한 관심을 받을 만하다고 생각하지만, 적절한 인간 질병의 생물학적 모델을 이용한 실험을 통해 배아줄기세포의 특성, 합병증의 가능성, 장기적 결과에 대한 자세한 연구가 필요하다고 주장합니다(줄기세포와 미래 재생 의학 국립 아카데미 출판부; 줄기세포와 미래 연구 방향. 미국 국립 보건원).

이러한 관점에서, ESC 현탁액을 고환에 이식하여 얻은 실험적 기형종과 ESC를 포함하는 초기 배아의 이식 결과로 형성된 기형종의 비교 조직학적 분석에서 ESC가 기원이나 특정 주변 세포와의 상호작용에 관계없이 동일한 방식으로 종양 형성 잠재력을 발휘한다는 사실이 중요하다. 이러한 기형종은 클론성 기원을 가지고 있음이 입증되었는데, 세 배엽의 유도체로 구성된 종양이 하나의 ESC에서 발생할 수 있기 때문이다(Rega, 2001). 정상 핵형을 가진 복제된 ESC를 면역 결핍 마우스에 이식했을 때, 다양한 유형의 분화된 체세포로 구성된 기형종도 형성되었다는 점은 주목할 만하다. 이러한 실험 데이터는 기형종의 클론성 기원에 대한 완벽한 증거이다. 발생생물학의 관점에서, 이들은 여러 개의 전능성 전구세포가 아니라, 단일 다능성 줄기세포가 기형종을 구성하는 세 배엽 모두의 분화된 파생물의 원천으로 작용한다는 것을 시사합니다. 그러나 실제 세포 이식을 위한 과정에서 이러한 연구 결과는, 비록 금지적인 것은 아니지만, 잠재적 위험을 경고하는 신호입니다. 성체 면역결핍 마우스의 다양한 조직에 배아줄기세포(ESC) 또는 원시 생식세포를 접종하면 이식된 줄기세포에서 종양이 필연적으로 발생하기 때문입니다. 이소성으로 이식된 배아줄기세포의 종양성 변성은 분화된 세포들의 위성 집단의 출현을 동반하는데, 이는 배아줄기세포와 전구세포 클론이 특수 세포주로 부분적으로 분화되기 때문입니다. 흥미롭게도, 배아줄기세포를 골격근에 이식했을 때, 신경세포는 기형암세포 옆에서 가장 자주 형성됩니다. 그러나 분열 중인 난자 또는 배반포에 배아줄기세포를 도입하면 종양성 요소의 형성 없이 세포가 배아에 완전히 통합됩니다. 이 경우, 배아줄기세포는 생식기 원기를 포함한 배아의 거의 모든 장기와 조직에 통합됩니다. 이러한 알로펜 마우스는 기형암종 129 세포를 8~100세포기의 초기 배아에 도입하여 처음 얻었습니다. 알로펜 마우스에서, 공여 배아줄기세포에서 유래한 이질성 세포 집단은 골수, 장, 피부, 간, 생식기 조직에 통합되어 실험에서 종간 세포 키메라를 생성할 수 있습니다. 초기 배아의 발달 기간이 짧을수록 세포 키메라화 비율이 높아지며, 알로펜 배아의 조혈계, 피부, 신경계, 간, 소장에서 가장 높은 키메라화가 관찰되었습니다. 성인 생물체에서 조직혈액 장벽에 의해 수용자의 면역 체계로부터 보호되는 조직은 키메라화에 취약합니다.고환 실질에 일차 생식 세포를 이식하는 것은 공여자 줄기 세포를 수혜자의 생식 조직층에 결합시키는 과정을 수반합니다. 그러나 배아줄기세포를 배반포에 이식할 때, 공여자 일차 생식 세포의 생성과 함께 생식 기관의 키메라적 퇴화는 일어나지 않습니다. 특수 조건이 조성되면 배아줄기세포의 다능성은 클로닝에도 활용될 수 있습니다. 예를 들어, 세포 분열이 사이토칼신에 의해 차단된 8-16세포 마우스 배아에 마우스 배아줄기세포를 이식하면, 공여자 배아줄기세포로부터 배아가 발달하면서 정상적인 배아 발생이 촉진됩니다.

따라서 동종이계 배아줄기세포 이식의 대안은 체세포 핵을 핵이 제거된 난자에 이식하여 배반포를 만든 후, 이 내세포괴에서 체세포핵 공여체와 유전적으로 동일한 배아줄기세포 계통을 분리하는 치료적 클로닝입니다. 체세포핵을 핵이 제거된 난자에 이식한 후 얻은 배반포에서 배아줄기세포 계통을 만드는 것이 실험실 동물 실험을 통해 반복적으로 입증되었기 때문에 기술적으로 이 아이디어는 상당히 실현 가능합니다(Nagy, 1990; Munsie, 2000). 특히, rag2 유전자 돌연변이에 대해 동형접합체인 마우스에서, 표피하 조직 세포를 배양하여 얻은 섬유아세포를 핵 공여체로 사용하여 핵이 제거된 난자에 이식했습니다. 난모세포 활성화 후, "접합자"를 배반포 형성까지 배양한 후, 배아줄기세포(ESC)를 내세포괴에서 분리하여 돌연변이 유전자(rag2~/~)에 대해 무접합인 세포주로 이식했습니다. 이러한 ESC에서 한 대립유전자의 돌연변이는 상동 재조합 방법을 통해 교정되었습니다. 첫 번째 실험 시리즈에서는 재조합 복원 유전자를 가진 ESC에서 배아체를 채취하고, 재조합 레트로바이러스(HoxB4i/GFP)를 형질감염시킨 후, 생식 후 rag2~/~ 마우스의 정맥에 주입했습니다. 두 번째 실험 시리즈에서는 사배체 할구를 유전자 변형 ESC와 함께 응집시켜 수혜자 암컷에게 이식했습니다. 그 결과 면역적격 마우스는 rag2~/~ 돌연변이 마우스에 이식하기 위한 골수 공여체 역할을 했습니다. 두 실험 시리즈 모두 결과는 양성이었습니다. 3-4주 후, 모든 마우스에서 면역글로불린을 생성할 수 있는 성숙한 정상 골수세포와 림프세포가 발견되었습니다. 따라서 체세포 핵을 난모세포에 이식하는 것은 배아줄기세포(ESC) 계통을 얻는 것뿐만 아니라, ESC를 교정 유전 정보 전달 벡터로 사용하여 유전적 이상을 교정하는 세포유전치료(cytogenotherapy)에도 사용될 수 있습니다. 그러나 이러한 세포 이식 방식은 생명윤리적 문제 외에도 한계가 있습니다. 특정 환자의 유전자형과 동일한 유전자형을 가진 치료 목적으로 복제된 세포를 이식하는 것이 얼마나 안전한지는 불분명합니다. 이러한 세포는 다른 질병에 대한 소인을 유발하는 돌연변이를 유발할 수 있기 때문입니다. 정상적인 인간 난자는 여전히 접근하기 어려운 반면, 체세포 핵을 핵이 제거된 동물 난자에 이식하더라도, 제작된 "접합자" 중 15~25%만이 배반포 단계로 발달합니다. 만능 복제 배아줄기세포 한 계통을 얻는 데 얼마나 많은 배반포가 필요한지는 아직 밝혀지지 않았습니다. 또한 치료 목적으로 복제하는 방법의 복잡성과 관련된 높은 재정적 비용도 주목할 만합니다.

결론적으로, 배아줄기세포(ESC)에서 저메틸화된 DNA를 가진 유전체의 다능성은 높은 텔로머라제 활성 및 세포 주기의 짧은 C^기와 결합되어, ESC의 집중적이고 잠재적으로 무한한 생식을 보장하며, 이 기간 동안 ESC는 이배체 염색체 세트와 "유년기" 표현형 특성을 유지합니다. 배양 중 ESC의 클론 성장은 증식이 중단되고 적절한 조절 신호가 추가될 때 생물체의 특정 세포주로의 분화를 방해하지 않습니다. 시험관 내에서 ESC의 체세포주로의 제한 분화는 중간엽의 참여 없이, 노치테이(Nochteys)를 우회하며, 기관 형성 과정 외부에서, 그리고 배아 형성 없이 이루어집니다. ESC를 생체 내 이소성으로 도입하면 필연적으로 기형암종이 형성됩니다. 배아줄기세포를 배반포 또는 초기 배아에 이식하면 배아 조직과의 통합 및 장기의 안정적인 키메라화가 수반됩니다.

세포 이식에 기반한 재생 가소성 기술은 세포생물학, 발생생물학, 실험유전학, 면역학, 신경학, 심장학, 혈액학을 비롯한 여러 실험 및 실용 의학 분야 종사자들의 관심 분야입니다. 실험 연구의 가장 중요한 결과는 줄기세포의 특성을 표적화하여 재프로그래밍할 수 있음을 입증하며, 이는 성장인자를 이용한 세포 분화 과정 제어, 즉 심근 재생, 중추신경계 손상 회복, 췌장 췌도 기능 정상화에 대한 가능성을 열어줍니다. 그러나 배아줄기세포 유래 이식이 실용 의학에 널리 도입되기 위해서는 인간 줄기세포의 특성을 더욱 심층적으로 연구하고 실험적 질병 모델을 대상으로 배아줄기세포를 이용한 실험을 지속해야 합니다.

동종이식 거부 반응 문제와 생명윤리적 문제는 성체 국소 줄기세포 유전체의 가소성 발견을 통해 해결될 수 있습니다. 그러나 분리되고 신중하게 특성화된 자가 조혈 세포를 간에 이식하면 새로운 간세포가 유래되어 간 소엽에 통합된다는 초기 정보는 현재 수정 및 비판받고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 신경 줄기세포를 흉선에 이식하면 새로운 공여자 T 및 B 림프구가 생성되고, 뇌 신경 줄기세포를 골수에 이식하면 장기 공여자 골수 및 적혈구 생성을 동반한 조혈 줄기가 생성된다는 데이터가 발표되었습니다. 결과적으로, 유전체를 배아줄기세포의 잠재력으로 재프로그램할 수 있는 만능줄기세포는 성체 장기에 지속될 수 있습니다.

의료 목적으로 배아줄기세포(ESC)를 얻는 원천은 여전히 인간 배아이며, 이는 인간 생명의 기원에서 도덕적, 윤리적, 법적, 종교적 문제의 새로운 교차점을 불가피하게 예견합니다. ESC의 발견은 살아있는 세포와 물질, 존재와 인격의 경계가 어디인지에 대한 격렬한 논의를 재개하는 데 강력한 자극을 주었습니다. 동시에, ESC를 의학에 사용하는 것에 관한 보편적인 규범, 규칙, 법률은 존재하지 않으며, 이를 제정하고 채택하려는 시도가 반복적으로 있었음에도 불구하고 존재하지 않습니다. 각 국가는 자국의 법률 체계 내에서 이 문제를 독립적으로 해결하고 있습니다. 한편, 전 세계 의사들은 배아줄기세포보다는 성체줄기세포 비축량을 주로 활용하여 이러한 논의의 범위를 넘어 재생가소성 의학을 시도하고 있습니다.

배아줄기세포 분리의 역사에 대한 간략한 소개

기형(배아)암 세포는 129/ter-Sv 마우스의 자연 발생 고환 기형종, Lt/Sv 마우스의 자연 발생 난소 기형종, 그리고 이소성으로 이식된 배아 세포 또는 조직에서 유래한 기형종으로부터 분리하였다. 이러한 방식으로 얻어진 안정적인 마우스 기형(배아)암 세포주 중 일부는 다능성을 보였고, 다른 세포주는 특정 세포 유형으로만 분화되었으며, 일부는 세포 분화가 전혀 불가능했다.

한때, 연구는 테라토-(배아)-암 세포를 발달 중인 배아 조직에 도입한 후 정상적인 표현형으로 되돌릴 수 있는 가능성을 시사하는 연구와, 인간 유전병리의 생물학적 모델링을 위해 돌연변이 마우스를 얻는 데 도움이 되는 유전자 변형 테라토-(배아)-암 세포의 시험관 내 생성에 관한 연구에 중점을 두었습니다.

조건부 현탁 배양을 통해 기형(배아)암종 세포주를 분리했습니다. 배양 과정에서 배아줄기세포(ESC)와 같은 기형(배아)암종 세포는 배아체를 형성하며, 세포주 이식을 위해서는 필수적인 분리가 필요합니다. 배아섬유아세포의 영양층이나 조건부 배지에서 현탁 배양하는 동안 다능성을 유지하기 때문입니다. 다능성 기형(배아)암종 세포주는 크고 구형이며, 높은 알칼리성 인산분해효소 활성을 특징으로 하고, 응집체를 형성하며 다방향으로 분화할 수 있습니다. 배반포에 도입되면 상실배와 응집되어 다양한 장기 및 조직 구성에서 기형(배아)암종 세포의 유도체가 발견되는 키메라 배아를 형성합니다. 그러나 이러한 키메라 배아의 대다수는 자궁 내에서 사멸하며, 생존한 신생 키메라의 장기에서는 이물질 세포가 거의 검출되지 않고 낮은 밀도로 존재합니다. 동시에 종양(섬유육종, 횡문근육종, 기타 악성 종양 및 췌장 선종)의 발생률이 급격히 증가하고, 키메라 배아의 자궁 내 발달 기간 동안 종양의 변성이 빈번하게 발생합니다.

정상 배아 세포의 미세환경에 존재하는 대부분의 기형(배아)암 세포는 거의 자연적으로 악성 신생물적 특징을 획득합니다. 비가역적 악성 종양은 구조적 재배열 과정에서 원암유전자(proto-oncogene)의 활성화에 기인하는 것으로 여겨집니다. 예외 중 하나는 마우스 고환 기형종(line 129/Sv-ter)에서 얻은 배아암 세포주 SST3입니다. 이 세포는 키메라 마우스에서 종양 형성 없이 배아의 조직과 기관에 통합되는 높은 능력을 보입니다. 키메라 마우스에서 기형(배아)암 세포주의 유래 세포는 사실상 원발성 생식모세포(gonocyte) 형성에 관여하지 않습니다. 이는 대부분의 기형(배아)암 세포주에서 특징적으로 나타나는 염색체 이상의 빈도가 높기 때문인 것으로 보이며, 이 세포에서는 이수성과 염색체 이상이 모두 관찰됩니다.

실험실 조건에서 다능성, 높은 증식 활성 및 배양 중 분화 능력을 특징으로 하는 여러 안정적인 인간 기형(배아)암종 세포주를 얻었습니다. 특히, 인간 기형(배아)암종 세포주 NTERA-2를 사용하여 신경 세포 분화 기전을 연구했습니다. 이 세포주의 세포를 신생 쥐의 전뇌의 뇌실하 영역에 이식한 후, 세포 이동과 신경 발생을 관찰했습니다. 기형(배아)암종 세포주 NTERA-2의 세포를 배양하여 얻은 신경 세포를 뇌졸중 환자에게 이식하려는 시도도 있었는데, 저자에 따르면 이를 통해 질병의 임상 경과가 개선되었습니다. 동시에 뇌졸중 환자에서 기형(배아)암종 세포주 NTERA-2 이식 세포의 악성 종양 사례는 없었습니다.

1980년대 초, 에반스와 마틴은 미분화 만능 마우스 배아줄기세포의 첫 번째 계통을 확보했습니다. 이들은 배반포의 내세포괴(배아모세포)에서 이 세포들을 분리했습니다. 분리된 배아줄기세포는 특수 배양 배지에서 다양한 인자의 영향을 받아 장기간 만능성과 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 능력을 유지했습니다.

"배아 다능성 줄기세포"라는 용어 자체는 Leroy Stevens의 것인데, 그는 담배 타르가 종양 발생 빈도에 미치는 영향을 연구하던 중 대조군의 선형(129/v) 마우스에서 고환 기형암종이 자연적으로 발생하는 것에 주목했습니다. 고환 기형암종 세포는 높은 증식률을 특징으로 했으며, 복강 내 체액이 존재할 경우 자발적으로 분화하여 신경세포, 각질세포, 연골세포, 심근세포, 그리고 모발과 뼈 조각을 형성했지만, 해당 조직의 규칙적인 세포 구조는 관찰되지 않았습니다. 배양 시, 기형암종 세포는 기질에 부착되지 않은 다능성 클론으로 성장하여 배아체를 형성한 후, 분열을 멈추고 신경세포, 신경교세포, 근육 세포, 심근세포로 자연적으로 무질서하게 분화했습니다. 스티븐스는 마우스 기형암종 129/v에서 다양한 특수 체세포로 분화할 수 있는 세포의 비율이 1% 미만이며, 분화 자체는 이러한 세포에 영향을 미치는 요인(복막액 조성, 배양액에 첨가된 성숙 세포 또는 조직의 산물)에 따라 달라진다는 것을 발견했습니다. 기형암종 세포 중 생식세포 계열의 배아 전구 세포가 존재한다는 리로이 스티븐슨의 가설은 확인되었습니다. 착상 전 배아에서 추출한 배아모세포를 성체 마우스 조직에 현탁하여 기형암종을 형성하였고, 이로부터 분리한 순수 세포주를 수혜자 동물에 복강내 투여한 결과, 세 배엽 모두에서 유래한 뉴런, 심근세포, 그리고 기타 체세포로 분화되었습니다. 생체 내 실험에서, 배아모세포에서 얻은 배아줄기세포(영양모세포에서 얻은 것이 아님)를 다른 계통의 생쥐 배아의 할구 단계 8~32에 이식한 결과, 종양이 발생하지 않은 키메라 동물이 탄생했으며, 그 장기에서 기증 조직의 싹이 발견되었습니다. 생식 세포주에서도 키메라 현상이 관찰되었습니다.

생쥐 배아의 생식기 퇴화에서 분리된 일차 전구 생식 세포는 형태, 면역학적 표현형, 그리고 기능적 특성 면에서 스티븐슨이 기형암종과 배아모세포에서 얻은 배아줄기세포와 일치했다. 배아줄기세포가 배반포에 도입된 후 태어난 키메라에서, 기관의 알로펜 형태형성은 간, 폐, 신장의 공여체와 수용체의 구조적 및 기능적 단위가 모자이크처럼 교차하는 특징을 보였다. 어떤 경우에는 수용체와 공여체 세포 모두로 구성된 장선와 또는 간소엽의 형성이 관찰되었다. 그러나 형태형성은 항상 수용체가 속한 종의 유전적 프로그램에 따라 이루어졌으며, 키메라 현상은 세포 수준에서만 제한되었다.

그 후, 중간엽 유래 세포(태아 섬유아세포)의 영양층에서 세포 분화 없이 배아줄기세포가 증식하는 것은 선택적 영양 배지에서 필수적으로 LIF가 존재할 때 발생하며, 이는 줄기세포와 전구세포만 선택적으로 생존시키고 대다수의 특수 세포 요소는 사멸시킨다는 것이 밝혀졌습니다. 이러한 방법을 사용하여 1998년 제임스 톰슨은 인간 배반포의 내세포괴에서 불멸화된 배아줄기세포 5주를 분리했습니다. 같은 해 존 게르하트는 4~5주 된 인간 배아의 생식결절에서 불멸화된 배아줄기세포 5주를 분리하는 방법을 개발했습니다. 이러한 독특한 특성 덕분에 불과 2년 후, 배아줄기세포와 완성조직 줄기세포가 재생 의학 및 유전자 치료에 사용되기 시작했습니다.